Введение

Эндокринотерапия (гормонотерапия – ГТ) является одним из основных методов лечения гормон-позитивного рака молочной железы (РМЖ), который встречается примерно в 75–80% случаев у женщин старше 50 лет и примерно в 60% случаев у женщин моложе 50 лет. Согласно устоявшейся парадигме, в лечении РМЖ в качестве адъювантной ГТ пациенток в пре- и постменопаузе предпочтение отдается тамоксифену, селективному модулятору эстрогеновых рецепторов, являющемуся стандартом в лечении гормон-позитивного РМЖ. Тем не менее в качестве альтернативы для женщин в постменопаузе возможно назначение ингибиторов ароматазы [1]. Поэтому персонифицированным подходом к назначению ГТ злокачественных новообразований является установление рецепторного статуса опухоли [2].

Механизм действия тамоксифена основан как на взаимодействии с гормональными рецепторами, так и на активации различных сигнальных путей, приводящих, например, к ингибированию протеинкиназы С, увеличению экспрессии металлопротеиназы-1, развитию окислительного стресса [3, 4]. Разный ответ на лечение пациентов с одинаковыми стадиями, возрастом, биологическими характеристиками опухоли может указывать на генетически обусловленную лекарственную устойчивость опухолевых клеток, связанную в т.ч. с процессом детоксикации тамоксифена [5]. Так, на эффективность лечения пациента может оказывать влияние полиморфизма генов системы биотрансформации ксенобиотиков. Глутатион-S-трансферазы (GST) относятся к ферментам II фазы биотрансформации, катализирующих конъюгацию глутатиона с широким спектром ксенобиотиков и эндогенных метаболитов [6]. Это суперсемейство состоит из

8 классов цитозольных форм: μ (GSTM), α (GSTA), π (GSTP), θ (GSTT), ζ (GSTZ), σ (GSTS) и ω (GSTO), наиболее изученные из которых GSTM и GSTT [7]. Одним из распространенных функциональных полиморфизмов GST являются протяженные делеции в структурных частях генов GSTM1 и GSTT1, приводящие к отсутствию соответствующих ферментов и как следствие – к изменению метаболизма эндогенных веществ и ксенобиотиков, в т.ч. лекарственных препаратов [8, 9]. В ряде исследований показано, что делеционный полиморфизм GST может быть связан с разным ответом на химиотерапию и прогнозом онкологических больных [10–13]. Однако сведения о влиянии полиморфных вариантов данных ферментов на эффективность ГТ при злокачественных образованиях практически отсутствуют.

Цель настоящей работы: изучение влияния делеционных полиморфизмов GSTT1 и GSTM1 на риск развития рецидива у больных гормон-позитивным РМЖ при лечении тамоксифеном.

Методы

В работе были исследованы образцы крови 102 женщин с диагнозом РМЖ IIA–III стадий в возрасте от 23 до 79 (средний возраст – 48±13) лет, получавших адьювантную ГТ. Все пациентки имели позитивный статус опухоли по рецепторам эстрогенов (люминальный А- или В-тип). Пациентки наблюдались в течение 5–7 лет, в ходе чего регистрировалось время наступления у них рецидива.

Образцы геномной ДНК, используемые для генотипирования, выделяли из венозной крови онкологических пациенток с помощью колоночного набора High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Швейцария) согласно инструкции производителя. Идентификацию делеционных полиморфизмов генов GSTM1 и GSTT1 проводили с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с последующим анализом кривых плавления продуктов реакции, как было описано ранее [14].

Для верификации рецидива РМЖ использовали общеклинические, лабораторные и инструментальные методы обследования пациенток с РМЖ, согласно стандартам оказания медицинской помощи. Определение статистических параметров осуществляли с помощью программ MS Excel и Statistica 12.0. Сравнение качественных признаков проводили с использованием таблиц сопряжѐнности 2×2 по χ²-критерию Пирсона с поправкой Йетса и точному критерию Фишера. Относительный риск (ОР) развития рецидива по конкретному признаку вычисляли с определением 95% доверительного интервала (ДИ). Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Исследование было выполнено в соответствии с приказом Минздрава РФ № 200н «Об утверждении правил надлежащей клинической практики» от 01.04.2016, Федеральным законом «Об обращении лекарственных средств» (№ 61-ФЗ от 12.04.2010) и Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека в качестве субъекта, в т.ч. исследований биологических материалов» (2013), стандартами CONSORT и GCP. От всех пациенток, участвовавших в исследовании, было получено письменное информированное согласие. Протокол исследования был утвержден на заседании этического комитета ФГБОУ ВО ТГМУ (протокол № 3 от 16.11.2020).

Результаты

В данной работе было проведено исследование делеционного полиморфизма генов GST у женщин с люминальным РМЖ, получавших тамоксифен. В ходе молекулярно-генетических экспериментов была выполнена идентификация генотипов GSTT1 и GSTM1:

• «нулевой» – характеризующийся гомозиготной делецией (0/0) и приводящий к полному отсутствию фермента;
• «функциональный» – несущий «нормальный» (функциональный) аллель в гомо- или гетерозиготном состоянии (+/+ или 0/+).

Распределение «нулевых» и «функциональных» генотипов GSTT1 и GSTM1 у исследуемых пациенток с рецидивом заболевания и без него представлено в таблице.

В ходе наблюдений установлено, что рецидив заболевания у пациенток с РМЖ, получавших адъювантную ГТ, наступил в 43 (42,2%) случаях из 102 (табл. 1), у 59 (57,8%) пациенток рецидив не был зарегистрирован. Частота встречаемости функционально активных форм GSTT1 составила 77,9 и 90,7% у пациенток с отсутствием и наличием рецидива РМЖ соответственно. При этом на долю «нулевого» генотипа GSTT1 (0/0) в группе с выявленным рецидивом пришлось только 9,3% случаев против 22,1% в безрецидивной группе. В результате анализа данных было установлено, что присутствие «нулевого» варианта GSTT1 уменьшает риск развития рецидива РМЖ в 1,9 раза (ОР=0,513; 95% ДИ: 0,211–1,246; χ²=2,909) по сравнению с носительством функционально активных форм GSTT1 (0/+, +/+). Однако в данном случае можно говорить только о наметившейся тенденции, т.к. статистически значимого различия в значениях выявлено не было (р=0,089).

Распространенность функционально активных форм GSTМ1 (0/+; +/+) в группах пациенток с рецидивом рака и без него составила 49,2 и 55,8% соответственно. «Нулевой» вариант GSTM1 был выявлен у 19 (44,2%) больных без рецидива и у 30 (50,8%) с рецидивом РМЖ. Согласно расчетам, риск развития рецидива РМЖ в группе пациенток с функционально неактивной формой GSTМ1 (0/0) был ниже в 1,2 раза (ОР=0,856; 95% ДИ: 0,541–1,356, χ²=0,442; p=0,507), однако полученное различие не имеет статистической значимости. То есть распределение генотипов GSTM1 не влияло на возникновение рецидива заболевания у женщин с гормонально-позитивным РМЖ.

Сочетание функционально «нулевых» генотипов GSTT1 (0/0) и GSTM1 (0/0) одновременно было установлено у 10 пациенток, среди которых рецидив РМЖ был детектирован только у 1 (10%). Встречаемость сочетанных «функциональных» генотипов GSTТ1 (0/+; +/+) и GSTМ1 (0/+; +/+) была гораздо выше и составила 46 (45%) случаев из 102. При этом их распределение в группах с рецидивом РМЖ и без него практически не различалось: 21 (45,6%) случай против 25 (54,4%). Среди проверенных комбинаций аллельных сочетаний 2 генов GST наименьший риск развития рецидива РМЖ оказался у носителей двойных делеций GSTT1-GSTM1. Согласно расчетам, у таких пациенток вероятность рецидива была ниже в 4,5 раза по сравнению с носителями «функциональных» генотипов GSTT1 и GSTM1 одновременно (ОР=0,219; 95% ДИ: 0,033–1,444, χ²=4,377; p=0,037).

Таким образом, был изучен вклад делеционного полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 в риск развития рецидива заболевания у пациенток с люминальным РМЖ, получавших адъювантную ГТ. Снижение вероятности рецидива было обнаружено при одновременном носительстве «нулевых» генотипов GSTT1 (0/0) и GSTM1 (0/0). На уровне тенденции также была зарегистрирована ассоциация «нулевого» варианта GSTT1 (0/0) с меньшим шансом развития рецидива РМЖ по сравнению с его «функциональным» генотипом.

Обсуждение полученных данных

Роль GST обычно рассматривается в контексте обезвреживания различных электрофильных ДНК-тропных соединений, которые используются в качестве базовых препаратов для проведения химиотерапии злокачественных новообразований [15]. Вместе с тем роль ферментов группы GST применительно к эффективности ГТ тамоксифеном практически не рассматривается, а сама ГТ зачастую воспринимается как фон для проведения адъювантного лечения [16]. Поэтому на сегодняшний день имеется ограниченная информация о влиянии GST на эффективность адъювантной ГТ. В работе J.H. Lin et al. было показано, что повышенная экспрессия глутатион-S-трансферазы класса μ3 у пациенток с РМЖ, регулируемая рецептором эстрогена, способна ослаблять цитотоксичность, индуцированную перекисью водорода, и приводить к резистентности опухолевых клеток к тамоксифену [17].

G. Yang et al. [16] обнаружили снижение смертности на 60% у женщин c РМЖ после лучевой терапии в комбинации с приемом тамоксифена в случае носительства ими гомозиготных аллелей GSTP1 105Val по сравнению с гомозиготным вариантом 105Ile. При этом какого-либо влияния делеционных полиморфизмов GSTT1, GSTM1 на выживаемость больных выявлено не было.

Известно, что ферменты семейства GST напрямую не метаболизируют тамоксифен, но принимают участие в инактивации свободных радикалов, возникающих в результате проапоптотического действия тамоксифена и свободнорадикальных метаболитов эстрогена (хиноны катехол-эстрогенов) посредством конъюгирования с глутатионом, тем самым предотвращая генотоксический и канцерогенный эффекты этих соединений [18].

В экспериментальных исследованиях на животных было продемонстрировано, что комбинированное лечение антиоксидантами с тамоксифеном повышало противоопухолевую активность последнего [19]. Вместе с тем антиоксиданты могут также снижать эффективность противоопухолевой терапии, защищая раковые клетки от апоптоза. Опухолевые клетки могут развивать резистентность к тамоксифену путем активации защиты от активных форм кислорода, опосредованной повышенным содержанием антиоксидантных ферментов [20].

Полученные в ходе данного исследования результаты свидетельствуют о том, что эффект от лечения тамоксифеном люминального типа РМЖ опосредованно связан с активностью ферментов GSTT1 и GSTM1, которые обеспечивают удаление электрофильных ДНК-тропных соединений. В контексте персонификации противоопухолевого лечения контингент пациенток с наличием сочетания делеции по генам GSTT1 и GSTM1 («нулевые» генотипы) могут рассчитывать на значительно меньший риск развития рецидива РМЖ в процессе и после окончания ГТ тамоксифеном. С другой стороны, больные РМЖ с наличием «дикого» типа генов GSTT1 и GSTM1 или гетерозиготные по этим генам вправе рассматриваться как кандидаты для более агрессивной адъювантной терапии.

Заключение

При изучении делеционных полиморфизмов генов глутатион-S-трансфераз у женщин с РМЖ выявлена значимая ассоциация сочетания «нулевых» генотипов GSTM1 и GSTT1 со снижением риска возникновения рецидива заболевания. Таким образом, носительство данных генотипов, приводящее к отсутствию соответствующих глутатион-S-трансфераз, может рассматриваться как благоприятный предикторный фактор при проведении адъювантной ГТ тамоксифеном больных люминальным типом РМЖ.

Вклад авторов. И.С. Гулян – сбор и обработка материала, написание текста рукописи. Е.В. Худченко – статистическая обработка. Е.В. Елисеева – редактирование текста, консультативная помощь. Е.П. Быстрицкая, Н.Ю. Отставных – обзор публикаций по теме статьи. В.И. Апанасевич – редактирование текста рукописи. М.П. Исаева – разработка дизайна исследования, редактирование текста рукописи.

Дополнительная информация

Публикация статьи осуществляется в рамках диссертационной работы: «Фармакогенетическая оценка влияния полиморфизма генов микросомальной эпоксидгидролазы, глутатионтрансфераз T1, М1 на эффективность химиотерапии».