HELICOBACTER PYLORI - ISOTOPIC DIAGNOSIS OF INFECTION AND TESTING OF RESISTANCE


N.V. Zaharova (1), V.I. Simanenkov (1), I.V. Savilova (1), A.V. Svarval (2)

(1) SBEI HPE "Northwestern State Medical University n.a. I.I. Mechnikov" of RMPH, St. Petersburg; (2) SRI of Epidemiology and Microbiology n.a. Pasteur, Saint-Petersburg
The article presents the results of the evaluation the incidence of H. pylori infection and the extent of infection in patients with functional dyspepsia based on the 13C-urea breath test urea. A total of 1929 patients were evaluated. High degree of contamination among patients with functional dyspepsia with Helicobacter pylori infection occurrence of 52% is revealed. A technique for bacteriological testing is described. The results of evaluation of H. pylori strains resistance by serial dilutions are presented. Among the analyzed isolates, 42.5% were resistant to metronidazole, 27.1% - to levofloxacin, 25% - to clarithromycin, and 6.3% - to amoxicillin. All tested strains were sensitive to tetracycline.

Введение

Своевременная диагностика и эрадикация Helicobacter pylori в настоящее время рассматриваются как приоритетная стратегия профилактики развития некардиального рака желудка, снижения риска рецидива язвенной болезни и излечивания от инфекционного хеликобактерного гастрита [1]. Сложности диагностики микроорганизма в России связаны с малой доступностью в большинстве регионов страны неинвазивных валидизированных высокочувствительных и специфичных методик верификации H. pylori – 13С-уреазного дыхательного теста и определения антигена хеликобактера в стуле с помощью моноклональных антител [2]. В силу особенностей культивирования H. pylori и сложности определения резистентности к антимикробным препаратам в большинстве случаев врачи не обладают информацией о чувствительности микроорганизма к антибиотикам. Перечисленные особенности зачастую приводят к гипердиагностике хеликобактерной инфекции, «слепой» (без тестирования на присутствие микроорганизма) эрадикации, затрудняют назначение адекватной эффективной терапии.

H. pylori имеет широкий спектр чувствительности к антимикробным препаратам in vitro [3, 4]. Однако в схемы эрадикации входит ограниченный набор препаратов (кларитромицин, амоксициллин, метронидазол, тетрациклин, левофлоксацин и препараты висмута) [2, 5]. Резистентность H. pylori к антимикробным препаратам является определяющим фактором эффективности существующих режимов эрадикации микроорганизма [5, 6].

Целью данной работы было получение данных о частоте инфицированности пациентов с гастроэнтерологическими жалобами и определении первичной резистентности штаммов H. pylori в Санкт-Петербурге.

Материал и методы

Проведено проспективное наблюдательное исследование, включившее пациентов, обратившихся к гастроэнтерологу или терапевту с жалобами на диспепсию. Всем больным выполнен 13С-уреазный дыхательный тест с меченой мочевиной – 13С-карбамидом. Принцип метода основан на высокой уреазно-ферментативной активности H. pylori, посредством которой происходит ферментативный гидролиз принятой внутрь меченой мочевины до углекислого газа и аммиака (рис. 1).

Процедура тестирования включала забор проб выдыхаемого воздуха до приема меченого субстрата и через 10, 20 и 30 минут после приема 13С-карбамида с усилителем уреазной активности хеликобактера лимонной кислотой.

В природе углерод встречается в виде двух стабильных нерадиоактивных изотопов: «легкого» с массовым числом 12 (12С) и «тяжелого» – с массовым числом 13 (13С). Распространенность 12С составляет 98,89%, 13С – 1,11%. Природное соотношение углеродов составляет 0,01122. Изотопной меткой препарата был стабильный нерадиоактивный 13-й изотоп углерод. Доказана прямая корреляция между уреазной активностью хеликобактера и приращением 13С-углерода в выдыхаемом воздухе после приема субстрата [7].

Содержание в выдыхаемом воздухе СО2 и соотношения 13С/12С стабилизированных изотопов определяли с помощью инфракрасного спектрометра IRIS (Kibion/Wagner, Швеция/Германия).

Кроме того, некоторым пациентам, согласившимся на эзофагогастродуоденоскопию (ЭГДС) и участие в протоколе «WPN-RUS-002 O», было выполнено бактериологическое исследование гастробиоптатов на H. pylori. Для участия в данном протоколе пациенты давали письменное информированное согласие, одобренное центральным и локальным научными этическими комитетами в соответствии с принципами Хельсинкской декларации.

В исследование резистентности были включены пациенты в возрасте от 18 до 65 лет с подтвержденной инфекцией H. pylori при проведении ЭГДС, подписавшие информированное согласие на участие в исследовании.

Критериям исключения соответствовали пациенты, ранее получавшие антимикробную терапию для эрадикации H. pylori или антибиотики группы макролидов или получавшие ингибиторы протонной помпы и препараты висмута в течение двух недель, предшествовавших исследованию.

В рамках протокола во время ЭГДС всем больным осуществлен забор гастробиоптатов для микробиологического исследования. Посевы сделаны в соответствии с отработанной методикой культивирования [8].

В качестве основы питательной среды для выделения и культивирования H. pylori использован Колумбийский агар. Инкубация посевов осуществлена в микроаэрофильных условиях при содержании кислорода около 5% в анаэростате системы GasPac100 c газогенерирующими пакетами типа GasPak. Идентификация выделенной культуры проведена на основании характерной морфологии культуры в мазке, окрашенном по Граму, и способности культуры к продукции уреазы.

Антибиотикорезистентность выделенных штаммов H. pylori изучали, используя метод серийных разведений на питательном агаре, содержащем определенные концентрации антибиотика. Определена чувствительность штаммов H. pylori к кларитромицину, амоксициллину, левофлоксацину, метронидазолу и тетрациклину [9]. Критерии распределения штаммов по степени чувствительности приведены в таблице.

Статистический анализ выполнен с помощью программного пакета IBM® SPSS Statistics, версия 21.0. Для дихотомических показателей резистентности были представлены 95% доверительные интервалы (ДИ) для долей резистентности к тому или иному антибиотику.

Результаты исследования

За 8 месяцев были обследованы 1929 пациентов, обратившихся к гастроэнтерологу или терапевту с диспепсическим синдромом. Всем пациентам выполнен четырехточечный 13С-уреазный дыхательный тест. Среди тестируемых пациентов 530 прошли курс эрадикации в течение 1–3 лет до исследования. Никому ранее уреазный дыхательный тест для контроля уничтожения микроорганизма не выполнялся. Эффективность эрадикационной терапии среди пролеченных лиц составила всего 75%. Частота встречаемости хеликобактера среди 1399 обследованных пациентов, не лечившихся от хеликобактерной инфекции и предъявлявших жалобы на диспепсию, составила 52% (положительный тест выявлен у 730 больных). Высокая степень инфицированности выявлена в 80% случаев (рис. 2).

В исследование резистентности были включены 109 инфицированных пациентов от 18 до 64 лет. Бактериологическим методом микроорганизм выделен лишь у 56 (51,4%) пациентов (95% ДИ – 42,0–60,8%). Такой низкий процент культивирования микроорганизма отражает технические трудности, связанные с транспортировкой и культивированием микроаэрофильного микроорганизма.

Чувствительность H. pylori к антимикробным препаратам удалось определить у 48 выделенных штаммов. Из-за скудного роста культуры в 8 случаях оценить антибиотикограмму было невозможно. Среди анализируемых изолятов H. pylori штаммов 17 (42,5%) были резистентны к метронидазолу, 13 (27,1%) – к левофлоксацину, 12 (25%) – к кларитромицину. Кроме того, было выявлено 3 (6,3%) штамма, устойчивых к амоксициллину. Все тестируемые штаммы были чувствительны к тетрациклину. В случае выявления резистентности к трем и более группам антимикробных препаратов штамм хеликобактера относили к полирезистентным. В ходе исследования 5 (11,1%) микроорганизмов были полирезистентными (рис. 3).

Двойная резистентность к кларитромицину и метронидазолу обнаружена у 2 (4,4%) изолятов, метронидазолу и левофлоксацину – у 4 (8,3%) микроорганизмов. Все штаммы, резистентные к амоксициллину, были устойчивы к кларитромицину.

Частота встречаемости резистентных штаммов различалась у мужчин и женщин, однако данный факт сложно интерпретировать из-за малой выборки (рис. 4).

Обсуждение

Существует много методов диагностики хеликобактерной инфекции. Однако эксперты в качестве приемлемых информативных неинвазивных методик рассматривают 13С-уреазный дыхательный тест с мочевиной и определение антигена H. pylori в стуле с помощью моноклональных антител, что отражено в Маастрихтских рекомендациях IV пересмотра [10]. В нашем исследовании применялся 13С-уреазный мочевинный дыхательный тест, позволивший не только оценить факт наличия инфекции, но и судить о степени инфицированности пациентов на основании динамики приращения меченого 13С в выдыхаемом воздухе [7]. Среди обследованных пациентов с жалобами на функциональную диспепсию 52% были инфицированы. До начала исследования мы предполагали выявить более высокую частоту встречаемости хеликобактерной инфекции среди пациентов с диспепсическими жалобами. В данное исследование не включено тестирование здоровых лиц, и, следовательно, мы не можем оценить популяционную инфицированность. Но, вероятно, при таком уровне инфицированности пациентов с гастроэнтерологическими жалобами частота встречаемости инфекции в популяции будет ниже. Настораживает факт высокой степени инфицированности пациентов – в 80% случаев. При этом инокулюм-эффект (при высокой концентрации бактерий возбудителя возрастает минимальная ингибирующая концентрация и снижается бактерицидная активность антибиотиков) играет негативную роль, снижая вероятность успешного лечения от инфекции [11]. Кроме того, предпосылкой к снижению эффективности схем эрадикации на основе кларитромицина является выявленный нами высокий уровень резистентности, превышающий 20%-ный порог.

В опубликованных отечественных работах в большинстве случаев выводы о кларитромицин-резистентности H. pylori сделаны на основании метода полимеразной цепной реакции, тогда как доказана низкая корреляция между фенотипическим и генотипическим методами определения чувствительности H. pylori [12–15]. В нашем исследовании использован наиболее информативный метод диагностики резистентности H. pylori-инфекции – бактериологический метод серийных разведений. При применении аналогичной методики тестирования на основании изучения 133 штаммов, выделенных от пациентов в Смоленске, получены данные о низкой резистентности хеликобактера к кларитромицину [16]. В Санкт-Петербурге резистентность к кларитромицину составила 25%, что иллюстрирует межрегиональные различия в частоте назначения антибиотиков и как следствие – различия в чувствительности микроорганизмов.

Фенотипический метод определения чувствительности к антибиотикам рекомендован Институтом по клиническим и лабораторным стандартам (CLSI), EUCAST, а также Маастрихтским соглашением IV пересмотра в качестве основного метода определения чувствительности H. pylori к кларитромицину [9, 10]. Культуральный метод является высокоспецифичным тестом, однако характеризуется низкой чувствительностью [17, 18]. Даже при четком соблюдении всех правил транспортировки материала и культивирования чувствительность в нашем исследовании составила 51,4%. Объективные сложности работы с культурой микроаэрофильного микроорганизма объясняют отсутствие широко представленных данных об истинном состоянии антибиотикорезистентности в различных регионах нашей страны.

Выводы

  1. Среди пациентов с функциональной диспепсией инфицированность H. pylori составляет 52%.
  2. Преобладает высокая степень инфицированности H. рylori.
  3. Выявлен высокий уровень первичной резистентности к кларитромицину – 25%, и левофлоксацину – 27,1%.
  4. Резистентность к метронидазолу составляет 42,5%.


Literature


  1. Wald N.J. The treatment of Helicobacter pylori infection of the stomach in relation to the possible prevention of gastric cancer. In: IARC Helicobacter pylori Working Group. Helicobacter pylori Eradication as a Strategy for Preventing Gastric Cancer. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer (IARC Working Group Reports. 2014;8:174–80. http://www.iarc.fr/en/publications/pdfs-online/wrk/wrk8/index.php.
  2. Ивашкин В.Т., Шептулин А.А., Лапина Т.Л. и др. Рекомендации Российской гастро-энтерологической ассоциации по диагностике и лечению инфекции Helicobacter pylori у взрослых. Росс. журн. гастроэнт., гепатол., колопроктол. 2012;1:87–9.
  3. Lambert T., Megraud F., Gerbaud G., Courvalin P. Susceptibility of Campylobacter pyloridis to 20 antimicrobial agents. Antimicrob. Agents Chemother. 1986;30:510–11.
  4. McNulty C.A., Dent J., Wise R. Susceptibility of clinical isolates of Campylobacter pyloridis to 11 antimicrobial agents. Antimicrob. Agents Chemother. 1985;28:837–38.
  5. Дехнич Н.Н., Захарова Н.В., Кузьмин-Крутецкий М.И., и др. Резолюция экспертного совещания «Тактика ведения пациента с инфекцией Helicobacter pylori. От простого к сложному». Клин. микробиол. и антимикробная хим. 2014;16(3):176–80.
  6. Lee J.W. GenoType HelicoDR test in the determination of antimicrobial resistance of Helicobacter pylori in Korea. Scand. J. Gastroenterol. 2014;24:1–10.
  7. Рапопорт С.И., Шубина Н.А. 13С-дыхательный тест – возможности и ограничения в диагно-стике заболеваний органов пищеварения. М., 2014. 233 с.
  8. Жебрун А.Б., Сварваль А.В., Ферман Р.С., Гончарова Л.Б. Методы лабораторной диагностики инфекции, обусловленной Helicobacter pylori. СПб., 2014. 60 с.
  9. EUCAST. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. 2013;Version 3.1. Available from: URL:http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Consultation/EUCAST_clinical_breakpoints_for_Helicobacter_pylori.pdf.
  10. Malfertheiner P., Megraud F., O’Morain C., Atherton J., Axon A.T., Bazzoli F., Gensini G.F., Gisbert J.P., Graham D.Y., Rokkas T., El-Omar E.M., Kuipers E.J. Management of Helicobacter pylori infection – the Maastricht IV. Florence Consensus Report. Gut. 2012;61(5):646–64.
  11. Queenan A.M., Foleno B., Gownley C., et al. Effects of inoculum and beta–lactamase activity in AmpC– and extended–spectrum beta–lactamase (ESBL)–producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae clinical isolates tested by using NCCLS ESBL methodology. J. Clin. Microbiol. 2004;42:269–75.
  12. Успенский Ю.П., Барышникова Н.В. Helicobacter pylori-ассоциированные забо-левания: патогенез, особенности диагностики и дифференцированное лечение. Учебно-методическое пособие. 2010. 40 с.
  13. Корниенко Е.А., Суворов А.Н., Ткаченко Е.И. и др. Критический рост резистентности Helicobacter pylori к кларитромицину в педиатрической и взрослой гастро-энтерологической практике. Справочник поликлинического врача. 2010;12:54–6.
  14. Осипенко М.Ф., Бикбулатова Е.А., Шакалите Ю.Д., Чернова Л.Н., Устинов С.Н., Куликов И.В., Максимов В.Н. Резистентность Helicobacter pylori к кларитромицину в Новосибирске. Эксперим. и клин. гастроэнтерология. 2012;8:15–7.
  15. Абдулхаков Р.А., Абузарова Э.Р., Абдулхаков С.Р., Сафин А.Г., Сайфутдинов И.М., Чернов В.М., Чернова О.А. Резистентность Helicobacter pylori к кларитромицину в Казани. Эксперим. и клин. гастроэнтерология. 2012;8:24–9.
  16. Дехнич Н.Н., Костякова Е.А., Пунин А.А., Алимов А.В., Иванчик Н.В., Козлов Р.С. Антибиотикорезистентность H. pylori: результаты микробиологического регио-нального исследования. Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2011;21(2):37–42.
  17. Жебрун А.Б., Сварваль А.В., Ферман Р.С. Исследование антибиотикорезистентности штаммов H. pylori, циркулирующих в Санкт-Петербурге в современный период. Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер. 2008;2(прил. 1):18–9.
  18. Симаненков, В.И., Захарова Н.В., Жебрун А.Б., Сварваль А.В., Савилова И.В., Ферман Р.С. Резистентность Helicobacter pylori к антимикробным препаратам по результатам бактериологического тестирования. Лечащий врач. 2015;4:91–5.


About the Autors


N.V. Zakharova – Doctor of Medical Sciences, Prof., Department of Therapy and Clinical Pharmacology SBEI HPE NWSMU n.a. I.I. Mechnikov of RMPH, St. Petersburg; e-mail: nvzakharova@mail.ru.


Similar Articles


Бионика Медиа