Введение

Изучение атеросклероза и его осложнений – одно из приоритетных направлений научных исследований в области неврологии и фундаментальных наук, поскольку сосудистую патологию по праву можно считать эпидемией нашей эпохи. Актуальность проблемы требует изучения механизмов, реализующих развитие поражения сосудистой стенки, формирование очага ишемии, в т.ч. связанных с вовлечением иммунной системы, реакциями врожденного иммунитета, локальным воспалительным ответом и других.

Воспаление – универсальная защитная реакция, направленная на освобождение организма от любых патогенных влияний и последствий повреждения, лежащая в основе в т.ч. ведущего фактора повреждения сосудистой стенки – атеросклероза. Врожденный иммунитет обеспечивает специфическое распознавание патогенов с помощью генетически запрограммированных паттерн-распознающих рецепторов (PRRs), взаимодействующих с патоген-ассоциированными молекулярными «образами» (DAMPs) РНК и ДНК вирусов и бактерий, липополисахаридом бактериальной стенки грамотрицательных бактерий. Реакция организма на любое повреждающее воздействие заключается в активации генов немедленного реагирования и адаптивного ответа, которые активируются посредством передачи сигнала в ядро клетки через сигнальные PRRs-рецепторы. Наиболее значимые из PRRs-рецепторов – это Tolllike рецепторы (TLRs). До настоящего времени идентифицировано 10 TLRs человека [1, 2].

TLRs экспрессируются на мембранных структурах иммунных клеток (макрофаги, моноциты, нейтрофилы, лейкоциты, тучные и дендритные клетки). Также имеются данные об экспрессии TLRs на эпителиальных клетках кишечника, респираторного и урогенитального трактов, эндотелии сосудов, кардиомиоцитах, гепатоцитах, клетках кожи и почечного эпителия, адипоцитах, инсулинчувствительных тканях [3]. TLR2, TLR4 и TLR6 функционируют в качестве основных врожденных рецепторов у млекопитающих для распознавания компонентов клеточной стенки бактерий. Ключевую роль в реализации реакций врожденного иммунитета играют TLR4, активация которых сопровождается экспрессией генов цитокинов и других сигнальных пептидов. Рецептор TLR2 уникален своей способностью образовывать гетеродимеры с TLR1 и TLR6 на поверхности цитоплазматической мембраны, что обеспечивает широкий диапазон распознавания патоген-ассоциированных молекулярных паттернов [4].

TLRs представляют собой трансмембранные одноцепочечные сигнальные рецепторные белки, имеющие внеклеточную и внутриклеточную части. Внеклеточная часть TLRs связывается с лигандами микроорганизмов, внутриклеточная часть TLRs, гомологичная внутриклеточному домену интерлейкина 1 (ИЛ-1), взаимодействует с адаптерными молекулами внутриклеточных сигнальных путей и активирует индукцию экспрессии провоспалительных генов и синтеза интерферонов 1-го типа, а также апоптоза.

На сегодняшний день известно, что в основе дестабилизации атеросклеротических бляшек и дисфункции эндотелия лежат воспалительные реакции, связанные с активацией TLRs и индукцией синтеза провоспалительных цитокинов. TLRs являются ключевым активатором моноцитов и макрофагов. Накапливающиеся в атеросклеротических бляшках липопротеины низкой плотности, белки теплового шока и компоненты микроорганизмов, проникающих под фиброзную покрышку, служат эндогенными лигандами для TLR4 [5]. Вследствие активации TLRs развивается асептическое воспаление стенки сосуда с выбросом метаболитов арахидоновой кислоты, кислородных радикалов, дегрануляцией лейкоцитов, выходом в ткани эластазы и протеолитических ферментов, простагландинов и фактора, активирующего тромбоциты [6–9]. Помимо этого активация TLRs запускает каскад основных проатерогенных цитокинов (ИЛ12, -18, фактор некроза опухоли-α). Формируется своеобразный «порочный круг» ускорения атерогенеза и тромбообразования, способных вызывать серьезные осложнения (нестабильную стенокардию, инфаркт миокарда – ИМ, ишемический инсульт – ИИ) [10]. Эпидемиологические и клинические исследования показывают, что хроническое воспаление и инфекция увеличивают риск ишемической болезни сердца и атеросклероза, а также связанных с ними сердечнососудистых осложнений, таких как инсульт и инфаркт [10, 11].

Масса исследований расширили представления об участии иммунного ответа, воспалительных реакций, генетических и молекулярных механизмов апоптоза в патогенезе ИИ. Было показано, что при формировании церебрального инфаркта существует дисбаланс цитокинового статуса с дефицитом защитных противовоспалительных цитокинов и трофических факторов, выраженность которого коррелирует с тяжестью и клиническим исходом инсульта. В ряде исследований показано, что на моноцитах периферической крови пациентов с нестабильной стенокардией, ИМ и хронической сердечной недостаточностью выше уровни экспрессии TLR2 и TLR4, чем у пациентов со стабильной стенокардией или здоровых людей [12]. У больных ИМ с подъемом сегмента ST повышенная экспрессия TLR4 служит независимым предиктором 30-дневных основных неблагоприятных клинических исходов [13]. Установлена связь рецепторов TLR4 с объемом экспериментального церебрального инфаркта и последующим функциональным исходом [14, 15]. Прямая зависимость объема инфаркта мозга от уровня экспрессии TLR4 связана с повышением синтеза провоспалительных цитокинов индуцибельной NO синтазы (iNOS) и интерферона-γ, усугубляющих церебральное повреждение [16]. Также уровень экспрессии TLR4 напрямую связан с инфильтрацией очага некроза нейтрофилами и моноцитами, а также с активностью микроглии. Так, у TLR4-дефицитных мышей заметно снижено воспаление на границе с зоной ишемии [17].

Микроглиальные клетки в условиях церебральной ишемии также способны усиливать повреждение нейронов посредством экспрессии TLR2 с последующей активацией экспрессии провоспалительных медиаторов (ИЛ-17, -23 и др.) и апоптоза [18, 19]. Функциональная значимость TLR2 в развитии ИИ доказана опытным путем: у мышей с нокаутом гена TLR2 объем инфаркта мозга намного меньше, чем у мышей дикого типа.

Причины разного прогноза и динамики заболевания у пациентов с ИИ при изначально одинаковых степенях тяжести и локализации сосудистого поражения требуют дальнейшего изучения. Накопленные экспериментальные данные свидетельствуют: TLR4 и TLR2 играют важную роль в модулировании воспалительного ответа, вызванного церебральной ишемией. Однако роль TLRs в организме больных ИИ на системном уровне до сих пор не установлена, что делает интересным изучение изменений экспрессии генов врожденного иммунитета (TLR2 и TLR4) в лейкоцитарной массе пациентов с ИИ для оценки уровня воспаления и возможного прогнозирования исходов инсульта.

Методы

В основную группу исследования были включены 28 человек, госпитализированных в клинику кафедры неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики лечебного факультета ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ с ИИ различной степени тяжести по шкале NIHSS, в т.ч. 10 женщин (средний возраст – 73,6±13,0 лет) и 18 мужчин (средний возраст – 68,9±10,0 лет).

В исследование включались больные в первые 24 часа от момента развития ИИ, добровольно подписавшие информированное согласие. Диагноз ИИ был подтвержден результатами нейровизуализации, также был проведен необходимый объем исследований для уточнения патогенетического варианта заболевания (липидограмма, уровень глюкозы, коагулограмма, дуплексное сканирование брахиоцефальных артерий, ЭКГ, ЭХО-КГ).

Контрольную группу составили здоровые доноры (18 человек, среди которых были 9 женщин [средний возраст – 68,3±5,0 лет] и 9 мужчин [средний возраст– 60,3 лет±7,0 лет]) с отсутствием острых и хронических воспалительных заболеваний и инсульта в анамнезе.

Проводили сравнительное изучение уровней экспрессии генов TLR2 и TLR4 у пациентов с ИИ и здоровых лиц. В качестве исследуемого материала в работе использована лейкоцитарная масса, полученная из цельной крови в соответствии со стандартным протоколом, с использованием стерильного 6%-ного раствора декстрана, серии отмывок и центрифугирования. Из лейкоцитов крови выделяли общую РНК жидкостнофазным методом, использовав набор «РИБОсорб» (ИнтерЛабСервис, Россия) по инструкции производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора для проведения реакции обратной транскрипции (Синтол, Россия) для синтеза ДНК на матрице РНК интересующего гена (TLR2 и TLR4) с последующим определением числа копий с помощью ПЦР в реальном времени. Реакцию проводили с применением набора реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBRGreenI и праймеров, синтезированных на фирме «Синтол» (Россия). Количество копий ДНК изучаемых генов рассчитывалось относительно актина. Реакцию проводили в амплификаторе ДТ-96.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета «STATISTICA.10» и программы Microsoft Excel, 2010. Достоверность результатов оценивали при помощи непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Работа выполнена на базе кафедры иммунологии МБФ ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова.

Результаты исследования

На первом этапе исследования проводили сравнение уровней экспрессии изучаемых генов (TLR2 и TLR4) в группе здоровых доноров. Выявлено, что экспрессия изучаемых рецепторов врожденного иммунитета в организме здоровых доноров низкая (медиана экспрессии гена TLR4 составляет 2741, TLR2 – 2453 копии/мкл). Также установлено, что экспрессия гена TLR4 превышает экспрессию TLR2 в контрольной группе незначительно (в 1,11 раза). Получив «фоновые значения» уровней экспрессии изучаемых генов, на следующем этапе провели сравнение экспрессии генов TLR2 и TLR4 у больных ИИ на 1-е, 3-и и 7-е сутки после его развития с контрольной группой.

Было установлено, что за 1-е сутки после развития инсульта экспрессия гена TLR4 у пациентов с ИИ достоверно превышала экспрессию данного гена у здоровых доноров в 1,46 раза (р<0,01) и составляла 4011 копий/мкл. А экспрессия гена TLR2 у больных ИИ достоверно превышала таковую изучаемого гена в контрольной группе в 1,39 раза (p<0,01) и составляла 3411 копий/мкл соответственно (рис. 1).

Показано, что на 3-и сутки после развития инсульта экспрессия гена TLR4 у пациентов с ИИ достоверно превысила экспрессию изучаемого гена в группе контроля в 1,36 раза (p<0,01) и составила 3729 копий/мкл. Экспрессия гена TLR2 у больных ИИ достоверно превысила экспрессию данного гена у здоровых доноров в 1,13 раза (p<0,01) и составила 3411 копий/ мкл (рис. 2).

За 7-е сутки после инсульта экспрессия гена TLR4 у больных ИИ достоверно превысила экспрессию интересующего гена у здоровых доноров в 1,61 раза (p<0,01) и составила 4416 копий/мкл. Экспрессия гена TLR2 у больных ИИ достоверно превысила экспрессию данного гена по сравнению с группой контроля в 1,33 раза (p<0,01) и составила 3270 копий/мкл (рис. 3).

На последнем этапе проводилось сравнение экспрессии генов TLR2 и TLR4 в динамике (на 1-е, 3-и и 7-е сутки после развития ИИ).

Наиболее высокий уровень экспрессии гена TLR4 отмечен на 7-е сутки болезни у пациентов, перенесших ИИ. При этом на 3-и сутки имело место снижение экспрессии гена TLR4 по сравнению с 1-и сутками болезни (рис. 4).

Что касается гена TLR2, то установлено, что наиболее высокий уровень его экспрессии наблюдался в 1-е сутки болезни пациентов. При этом на 3-и сутки отмечено снижение экспрессии гена TLR2, на 7-е сутки – подъем уровня его экспрессии, который был ниже по сравнению с 1-м днем болезни (рис. 5).

Обсуждение

В ходе исследования установлено, что экспрессия гена TLR4 достоверно превысила таковую TLR2 на 1-е, 3-и и 7-е сутки после развития ИИ.

Возможной причиной более высокой экспрессии TLR4 по сравнению с TLR2 стало большее количество DAMPs, взаимодействовавших с TLR4 при развитии ишемического повреждения головного мозга [20, 21].

При оценке изменения экспрессии генов TLR2 и TLR4 установлено, что экспрессия изучаемых генов достоверно превысила таковую генов в контрольной группе во всех точках исследования. При этом она максимальна в 1-е сутки, несколько снижается на 3-и сутки, а на 7-е сутки вновь отмечается увеличение экспрессии.

Снижение экспрессии изучаемых генов на 3-и сутки заставляет задуматься о наличии возможных механизмов ранней защиты мозговой ткани от повреждения, активации противовоспалительных и антиапоптозных механизмов. В поддержку этой теории свидетельствуют найденные в изученной литературе экспериментальные данные, указывающие на наличие признаков восстановления нервной ткани в головном мозге мышей через 3 суток после создания модели ишемии, хотя одновременно с этим продолжается и развитие патологических процессов [22]. Приведенные экспериментальные данные подтверждают нашу гипотезу о наличии возможных механизмов нейропротекции в остром периоде инсульта.

Относительно недавно опубликованы результаты исследований, в которых сообщается о нейропротективной роли белков теплового шока HSP70 и HSP27 в раннем периоде инсульта [18, 23–25]. Так, например, в области инфаркта мозга, особенно в периинфарктной зоне, через 48 часов после возникновения инсульта обнаруживается высокая экспрессия HSP70 [26]. В ряде исследований сообщается, что HSP70 способен регулировать восстановление других белков при ишемии мозга, участвуя в их рефолдинге, либо в их денатурации [24]. В любом случае данный процесс помогает клеткам пережить стрессовые условия и улучшает состояние пациентов.

В другом исследовании сообщается, что HSP70 способен регулировать апоптоз [23]. Например, вместе с кошапероном HSP40 он стабилизирует FANCC (ингибитор РНК-зависимой протеинкиназы R), следовательно, тормозит апоптоз [18]. К тому же HSP70 снижает активность JNK (с-Jun N-terminal kinase), связывает Apaf-1 и AIF, что в итоге сопровождается снижением активности апоптоза [25]. Сообщается о способности HSP70 блокировать работу BAX, тем самым снижая проницаемость наружных мембран митохондрий, что также приводит к ингибированию апоптоза [25]. Кроме того, имеются сведения, согласно которым HSP70 снижает передачу сигналов на NF-kB путем связывания IKK (киназы IkB), что приводит к снижению синтеза провоспалительных цитокинов [23].

Установлена нейропротективная роль HSP27 в развитии ИИ. Фосфорилированный HSP27 оказывает нейропротективные свойства [27]. Доказано, что HSP27 связывает ASK1, что приводит к снижению активности апоптоза [25]. Помимо этого HSP27 участвует в стабилизации цитоскелета астроцитов во время церебральной ишемии [27].

Имеются данные, свидетельствующие о нейропротективной роли micro-RNA в остром периоде инсульта [19, 28]. На модели окклюзии средней мозговой артерии in vivo показано антиапоптотическое действие miR-24 [28]. Помимо этого известно, что miR-223 способна регулировать работу N-метил-D-аспартата, что приводит к уменьшению поступления Са++ в нейроны, тем самым защищая мозговую ткань от ишемии [29].

Таким образом, имеющиеся данные позволяют предположить, что снижение экспрессии генов TLR2 и TLR4 на 3-и сутки после возникновения инсульта, возможно, связано с реализацией механизмов нейропротекции, в которых ведущую роль могут играть HSP70, HSP27, miR-21, miR-24 и miR-223. Поэтому необходимо продолжать исследования, направленные на определение взаимосвязи между уровнем экспрессии генов TLRs и описанных молекул.

Как уже отмечалось выше, на 7-е сутки в лейкоцитарной массе пациентов вновь происходит некоторое увеличение экспрессии генов TLR2 и TLR4. Вероятно, данный факт связан с развитием закономерных процессов продолжавшегося повреждения мозга. Имеются данные, согласно которым на 7-е сутки после инсульта усиливаются морфологические изменения нейронов и редукция их числа, некротические процессы в головном мозге [16, 22]. Гибель нейронов при ишемическом повреждении происходит по времени неоднородно, что вызвано участием различных механизмов – от стимуляции глутаматных рецепторов и «кальциевой перегрузки нейрона» до отсроченных процессов апоптоза [30].

Заключение

В результате проведенного исследования получены данные об изменении уровней экспрессии TLR2 и TLR4 в динамике, что позволяет оценивать изменение активности воспалительного процесса у больных ИИ на системном уровне. Необходимо продолжать исследования, направленные на определение взаимосвязи между уровнем экспрессии генов TLRs и процессами, происходящими в постишемическом периоде. Их результаты могут раскрыть новые мишени для терапии инсульта и ускорения восстановления функций мозга.