Введение

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) – один из наиболее распространенных гемобластозов, на долю которого приходится около 30% онкологических заболеваний у детей во всем мире [1]. Несмотря на значительные успехи в лечении этого заболевания, излечения достигают 94% пациентов, 75% испытывают побочные эффекты, связанные с терапией, и 1–3% имеют летальные осложнения [2, 3]. Исследователи отмечают значительную межиндивидуальную вариабельность лекарственной токсичности и исходов заболевания, что определяет роль фармакогенетики в выявлении генетических полиморфизмов в генахкандидатах (SNP) для оптимизации лечения ОЛЛ [4].

Метотрексат (MTX) – один из основных компонентов стандартизированных протоколов лечения ОЛЛ у детей ALL IC-BFM 2002/2009. В фазе консолидации ремиссии пациенты получают высокую дозу MTX (2000 или 5000 мг/м2), и после каждого введения оценивается его фармакокинетика [5]. Высокая концентрация MTX в плазме связана с токсичностью данной терапии. Ожидается, что улучшение исходов заболевания и снижение неблагоприятных эффектов и токсичности будут достигнуты путем поиска способа калибровки дозы MTX.

Результаты исследований, данные систематических обзоров [6–10] и мета-анализа [4] свидетельствуют о связи единственного гена SLCO1B1, влияющего на фармакокинетику MTX, полиморфизмы которого выявили геномные ассоциативные исследования (GWAS), что несколько удивительно, поскольку он экспрессируется исключительно в печени, а большая часть MTX выводится через почки [7]. Несмотря на это, энтерогепатическая циркуляция МТХ играет существенную роль в элиминации МТХ и реализации его токсических эффектов. Субстратами транспортера SLCO1B1 (OATP1B1) являются эндогенные молекулы, такие как билирубин и эстрогены, а также лекарственные препараты, в частности статины и MTX. SNP, наиболее часто тестируемый на ассоциацию с фармакокинетическими показателями MTX, является rs4149056, который кодирует переход T521C, понижающий экспрессию белка-транспортера на поверхности клетки и вызывающий значительное снижение доставки MTX in vitro [23]. Этот вариант был связан со снижением клиренса MTX во многих опубликованных исследованиях [13–23]. Долгосрочные результаты лечения ОЛЛ были хуже у пациентов с генотипом SLCO1B1 rs4149056 CC, чем у пациентов с TT или TC (5-летняя бессобытийная выживаемость [БСВ] 33,3±19,2% против 90,5±1,7%; р<0,001). Регрессионный анализ Кокса выявил ассоциации минимальной остаточной болезни (MRD) на 33-й день (отношение рисков [ОР]=3,458; p=0,002), MRD на 78-й день (ОР=6,330; p=0,001), SLCO1B1 rs4149056 (ОР=12,242; p<0,001) и SCL19A1 rs2838958 (ОР=2,324; p=0,019) с БСВ. Это показывает, что полиморфизмы в генах, кодирующих транспортеры MTX, существенно влияют на кинетику и ответ на терапию высокодозным MTX при детском ОЛЛ.

ATФ-связывающая кассета подсемейства B, член 1 (ген ABCB1), кодирует АТФ-зависимый насос для выведения лекарств, также называемый геном множественной лекарственной устойчивости, экспрессируется в клетках печени, почках и желудочно-кишечном тракте [6]. Ассоциация полиморфизмов в этом гене с фармакокинетикой МТХ изучена в 5 рандомизированных проспективных клинических исследованиях. Наиболее часто изучаемым SNP был rs1045642, в 4 исследованиях выявлено снижение клиренса MTX, связанное с аллелем rs1045642 [7–10], генотипы ABCB1 rs1045642 CT и TT имели статистически значимую корреляцию с БСВ (р<0,05) [7], а в другом исследовании не было обнаружено ассоциации SNP с БСВ [11]. Кроме того, была выявлена статистически значимая ассоциация между нейтропенией (абсолютное количество нейтрофилов <500/мкл) и носителями вариантов аллелей ABCB1 rs1045642 (OР=5,174; 95% ДИ: 1,674; 15,989) и ABCB1 rs1128503 (OР=3,364; 95% ДИ: 1,257; 9,004) соответственно [18]. Следует отметить, что не было обнаружено связи между мукозитом полости рта и каким-либо полиморфизмом генов-транспортеров МТХ [11].

Для выявления возможных ассоциаций вариантов генов ABCB1 и SLCO1B1 с фармакокинетикой MTX и токсичностью лечения в фазе консолидации ОЛЛ в российской популяции больных мы инициировали настоящее пилотное исследование.

Цель исследования

Оценить связь фармакогенетических показателей ABCB1 (C3435T rs1045642, rs1128503, rs2032582, rs4148738), SLCO1B1 T521C rs4149056 с основными видами токсичности метотрексата при лечении ОЛЛ у детей.

Методы

Дизайн исследования

Проведены ретрои проспективный анализы базы данных пациентов детского возраста с ОЛЛ в рамках наблюдательного (когортного) одноцентрового исследования.

Критерии соответствия

Критерии включения в исследование: дети (возраст от 7 месяцев до 18 лет) с ОЛЛ, получившие терапию препаратом МТХ в рекомендованных терапевтических дозировках согласно протоколам ALL IC-BFM 2002/2009 на базе НИИ детской онкологии и гематологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Критерии исключения: выраженная соматическая патология (печени, почек, сердечно-сосудистой и нервной систем), препятствующая проведению программной химиотерапии; психотическое состояние или тяжелое психическое заболевание в анамнезе (шизофрения, эпилепсия, биполярное расстройство и т.п.), способное влиять на согласие и возможность больного участвовать в исследовании; одновременный прием препаратов, влияющих на фармакокинетику и/или фармакодинамику МТХ (аспирин, пенициллины, пробеницид, тимидин, дазатиниб, иматиниб, омепразол).

Условия проведения

Поиск и набор участников исследования осуществлялись только среди пациентов, получавших терапию на базе НИИ детской онкологии и гематологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Продолжительность исследования

Период включения пациентов в исследование с 2016 по 2022 г.

Описание медицинского вмешательства

Для стратификации больных ОЛЛ на прогностические группы риска применены критерии протоколов ALL IC-BFM 2002/2009, доза МТХ зависела от прогностической группы риска (2000 мг/м2 или 5000 мг/м2); для оценки побочных эффектов использована оценка состояния больного с помощью визуальных аналоговых шкал, а также лабораторных методов (общий и биохимический анализы крови) с использованием шкал токсичности NCI (CTCAE v5.0 2018 года); для исследования полиморфизмов генов ABCB1 и SLCO1B1 применен метод ПЦР в режиме реального времени. Забор материала (периферическая венозная кровь) проводился однократно независимо от сроков терапии МТХ.

Основной исход исследования

Истинная конечная точка исследования – ассоциации генов и нежелательных явлений 3–4-й ст., связанных с действием МТХ, которая рассчитывалась как доля пациентов с нежелательными явлениями от общего числа пациентов с определенным аллельным вариантом SNP, рассчитанным с помощью критерия χ2.

Анализ в подгруппах

Были сформированы подгруппы пациентов в зависимости от степеней тяжести гепатотоксичности (ГТ), гематологической токсичности (ГемТ), орофарингельного мукозита (ОМ), инфекционных осложнений (ИО). Степени тяжести токсичности были объединены: 1-я, 2-я и клинически значимые 3–4-я ст. Сформированные подгруппы были сопоставимыми по возрастно-половому составу и группам риска ОЛЛ.

Методы регистрации исходов

Данные клинических, лабораторных и инструментальных исследований, свидетельствующие о ГТ, ГемТ, ОМ и ИО. Результаты ПЦР-исследований генов-транпортеров МТХ ABCB1 и SLCO1B1.

Этическая экспертиза

Протокол лечения ALL IC-BFM-2002 является клинической рекомендацией Минздрава России. Протокол ALL IC-BFM-2009 широко применяется в странах Европы, Азии и Латинской Америки, утвержден на заседании Ученого совета и Протокольного комитета НИИ ДОГ ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Протокол анализа фармакогенетических параметров токсичности утвержден на заседании Протокольного комитета НИИ ДОГ ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывался. Нулевая гипотеза – предполагаемая частота нежелательных реакций 3–4-й ст. не ассоциирована с полиморфизмами генов ABCB1 и SLCO1B1. Альтернативная гипотеза – предполагаемая частота нежелательных реакций 3–4-й ст. ассоциирована с полиморфизмами генов ABCB1 и SLCO1B1. Ошибка первого рода α<0,05, ошибка второго рода β=0,2.

Для переменных, отражающих различные признаки, применяли методы описательной статистики. Для анализа ассоциаций применялись критерии χ2 Пирсона, различия считались значимыми при p<0,05. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы IBM SPSS Statistics 21.0.

Результаты исследования

Участники исследования

Объектом исследования были пациенты детского возраста с впервые диагностированным ОЛЛ, результаты анализа ретрои проспективной баз данных.

Основные результаты исследования

Были исследованы образцы периферической крови 67 пациентов мужского (n=33) и женского пола (n=34) в соотношении 1:1. Возрастные группы больных: <1 года – 1,5%, 1–3 лет – 16,4%, 4–5 – 28,4%, 6–12 – 22%, 13–18 – 14%. Преобладал В-линейный иммуноподвариант ОЛЛ – 74,6%, Т-линейный – 25,4%.

Среди частот полиморфизмов гена SLCO1B1 T521C rs4149056 в исследуемой популяции чаще встречался ТТ – 80,6%, остальные варианты составили СС – 1,5% и ТС – 17,9%.

Среди частот полиморфизмов гена ABCB1C 3435T rs1045642 преобладал вариант ТС – 41,8%, остальные составили: ТТ – 31,3% и СС – 26,9%. Из полиморфизмов rs1128503 преобладал СС – 41,8%, а варианты СТ, ТТ и ТС составили 31,3, 25,4 и 1,5% соответственно. Среди полиморфизмов rs2032582 преобладал GG (46,3%), а варианты GT и ТТ составили 25,4 и 28,4% соответственно. Полиморфизмы rs4148738 были представлены следующим образом: ТТ – 47,8%, СС – 29,9%, СТ – 20,9%, ТС – 1,5%.

Распределение частот степеней тяжести ГТ в исследуемой популяции составило: 1–2-й ст. – 44,8% и 3–4-й ст. – 55,2% пациентов. ГемТ 1–2-й ст. отмечена у 4,5%, 3–4-й – у 95,5% пациентов. ОМ 1–2-й ст. встречался у 31,3%, 3–4-й – у 68,7% больных. ИО 0–2-й ст. регистрировались в 68,7%, 3–5-й – в 31,3% случаев.

Оценка токсичности проводилась в постцитостатическом периоде, а взаимосвязь с полиморфизмами указанных генов оценена с помощью таблиц сопряженности: для ABCB1C 3435T rs1045642 и ГТ χ2=3,433 (p=0,180), ГемТ – χ2=0,107 (p=0,948), ОМ – χ2=3,104 (p=0,212), ИО – χ2=0,651 (p=0,722). Для ABCB1 rs1128503 и ГТ χ2=2,690 (p=0,442), ГемТ – χ2=0,183 (p=0,980), ОМ – χ2=3,153 (p=0,369), ИО – χ2=8,43 (p=0,037). Для ABCB1 rs2032582 и ГТ χ2=2,491 (p=0,288), ГемТ – χ2=0,219 (p=0,896), ОМ – χ2=1,206 (p=0,547), ИО – χ2=4,645 (p=0,098). Для ABCB1 rs4148738 и ГТ χ2=2,583 (p=0,461), ГемТ – χ2=0,429 (p=0,934), ОМ – χ2=2,042 (p=0,564), ИО – χ2=5,738 (p= 0,125). Для SLCO1B1 T521C rs4149056 и ГТ χ2=3,380 (p=0,185), ГемТ – χ2=0,540 (p=0,764), ОМ – χ2=2,286 (p=0,319), ИО – χ2=7,364 (p=0,025).

Таким образом, при анализе широкого спектра токсических проявлений при терапии МТХ отмечено, что развитие ИО при лечении ОЛЛ у детей значимо ассоциировано с полимофизмами генов ABCB1 rs1128503 и SLCO1B1 T521C rs4149056.

Дополнительные результаты исследования

Снижение клиренса MTX, следовательно, более выраженное воздействие MTX на ткани потенциально ведут к повышенному риску MTXиндуцированной токсичности, что требует назначения фолината кальция в более высоких дозах. Кроме того, снижение функции белков – транспортеров MTX или ферментов фолатного пути может повышать внутриклеточную персистенцию MTX независимо от уровня MTX в плазме и таким образом приводить к повышению токсичности препарата, несмотря на нормальный системный клиренс MTX [4].

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

Развитие ИО в постцитостатическом периоде на фоне миелотоксического агранулоцитоза значимо ассоциировано с полимофизмами генов ABCB1 rs1128503 и SLCO1B1 T521C rs4149056.

Таким образом, нулевая гипотеза отвергнута лишь в контексте развития ИО в исследуемой популяции.

Обсуждение основного результата исследования

Как было указано в разделе «Введение», данные мировой научной литературы свидетельствуют о том, что была обнаружена статистически значимая ассоциация между нейтропенией 4-й ст. и носителями вариантов аллелей ABCB1 rs1128503 [18], что подтвердило и наше исследование. Остальные ассоциации токсичностей и полиморфизмов не были подтверждены, что также не противоречит данным зарубежных источников.

Ограничения исследования

Приведены результаты промежуточного анализа, которые не позволили демонстрировать статистическую значимость ассоциации между всеми исследуемыми признаками (вариантами токсичности) по причине малочисленности выборки, невозможности предварительного расчета выборки ввиду недостаточного количества литературных данных по каждому из исследуемых полиморфизмов генов, ответственных за фармакологический ответ МТХ. Необходимо применение более сложных методов статистической обработки данных и проведение комплексного анализа генетических полиморфизмов и их роли в развитии нежелательных лекарственных реакций МТХ у детей с ОЛЛ. Как было отмечено, исследование будет продолжено с целью получения окончательных результатов.

Заключение

Настоящее исследование подтверждает целесообразность дальнейшего изучения полиморфизмов генов, обеспечивающих транспорт и метаболизм МТХ, поскольку исследования дополнительных геномных и клинических данных позволят помочь врачам прогнозировать и своевременно профилактировать побочные эффекты терапии.

Вклад авторов. О.Д. Гурьева, М.И. Савельева, Т.Т. Валиев – разработка концепции и дизайна, написание статьи, обзор публикаций по теме статьи, сбор и анализ данных, научное редактирование статьи, окончательное одобрение рукописи.

Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки.