INFLUENCE OF REFNOT ON IMMUNITY IN CANCER PATIENTS


Z.G. Kadagidze, E.G. Slavina, A.I. Chertkova, M.E Abramov

FSBIS "Russian Oncological Research Center n.a. N.N. Blokhin", Moscow
New domestic immunomodulatorRefnot is a hybrid molecule of two biologically active agents – tumor necrosis factor α and thymosin α1. The article presents the results of evaluation of the effect of Refnot in combination with chemotherapy on the main indicators of immunity in patients with metastatic melanoma who had not received drug treatment for the disease dissemination previously. Immunophenotyping of peripheral blood lymphocytes using multiparametercytometry was performed at different stages of treatment. In combination with chemotherapy, Refnot had a positive impact on the main T-cell populations, as well as on natural killer cells and their cytotoxic activity.

Препарат Рефнот, разработанный НПП «Фармаклон», представляет собой гибридную молекулу рекомбинантного фактора некроза опухоли α (ФНО-α) и тимозина α1. Он состоит из 185 аминокислотных остатков, из которых последние 28 на С-конце являются последовательностью тимозина α1. ФНО-α был идентифицирован в 1975 г. в сыворотке мышей, инфицированных BCG и инъецированных липополисахаридом (LPS), как гликопротеин, способный индуцировать геморрагический некроз сарком, трансплантированных мышам подкожно [1]. В 1984 г. после клонирования ДНК ФНО-α был создан рекомбинантный человеческий ФНО-α, который вызывал геморрагический некроз трансплантированных сарком, индуцированных метилхолантреном у сингенных мышей [2]. ФНО-α способен индуцировать апоптоз, некроз и аутофагию опухолевых клеток различного происхождения. При определенных условиях ФНО-α может вызывать избирательную деструкцию кровеносных сосудов в опухоли, что играет большую роль в его противоопухолевом эффекте [3–5]. В условиях in vitro ФНО-α усиливает цитотоксическое и апоптотическое действие химиопрепаратов в отношении клеток злокачественных опухолей [6]. Этот цитокин синтезируется главным образом иммунными клетками (макрофагами, дендритными клетками, лимфоцитами) и оказывает значительное влияние как на врожденный, так и на адаптивный иммунитет. Он способен активировать Т- и дендритные клетки, что приводит к усилению противоопухолевого адаптивного иммунного ответа [5]. ФНО-α является основным регулятором иммунного и воспалительного ответа на опухоль, обладает выраженным цитотоксическим, цитостатическим и иммуномодулирующим эффектами [7]. Однако при системном введении рекомбинантный ФНО-α высокотоксичен для человека, что не позволяет достигать необходимых терапевтических доз. Таким образом, применение ФНО-α в медицине оказалось ограниченным его побочными эффектами и было временно прекращено. Начался поиск новых гибридных молекул на его основе [8, 9]. Значимые клинические результаты были получены при применении ФНО-α в монотерапии или в комбинации с мелфаланом при изолированной регионарной перфузии у пациентов с меланомой или саркомой конечностей. При меланоме объективный ответ был достигнут более чем 90% больных [10, 11]. Имеется также сообщение о регрессе неоперабельных метастазов колоректального рака при изолированной перфузии печени ФНО-α совместно с мелфаланом [7].

Тимозин α1 – естественный лимфопоэтический фактор тимуса, был впервые идентифицирован и охарактеризован A.L. Goldstein и соавт. [12]. Тимозин α1 является эндогенным регулятором как врожденного, так и адаптивного иммунитета [13]. В экспериментальных и клинических исследованиях тимозин α1 продемонстрировал противоопухолевую активность в комбинации с другими видами иммуно- и химиотерапии [14–16].

Таким образом, Рефнот является уникальным соединением – гибридной молекулой двух биологически активных агентов: цитокина ФНО-α и тимозина α1. Рефнот в отличие от ФНО-α характеризуется низкой системной токсичностью, однако сохраняет противоопухолевую активность данного цитокина.

В данной работе представлены результаты исследования влияния Рефнота в сочетании с химиотерапией на основные показатели иммунитета у больных диссеминированной меланомой кожи (ДМК) на разных этапах лечения.

Материал и методы исследования

В исследование были включены пациенты с ДМК, ранее не получавшие лекарственного лечения по поводу диссеминации болезни (n=21). Контролем служили доноры без признаков онкологических заболеваний (n=25). Все пациенты получали лечение по следующей схеме: Рефнот вводили в дозе 100–400 тыс. МЕ в 1–5-й дни подкожно с 2-дневными перерывами в течение 2–4 недель. Начиная с 3-й или 5-й недели проводили химиотерапию (дакарбазин 250 мг/м2 внутривенно струйно в дни 1–3, ломустин 80 мг/м2 внутрь в день 1 через 3 часа после дакарбазина, цисплатин 80 мг/м2 внутривенно в день 3).

Перерыв между курсами составил 2 недели. Состояние иммунитета определяли до начала лечения, после 2–4 недель терапии Рефнотом (до химиотерапии, 1 курс) и перед 2-м курсом химиоиммунотерапии. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проведено с помощью многопараметрового цитометрического анализа с использованием панели моноклональных антител производства компаний eBiocsience (USA) и «Сорбент» (Россия) к поверхностным маркерам лимфоцитов. Определено процентное содержание следующих популяций клеток в составе CD45+-лимфоцитов периферической крови: СD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+HLA-DR+, CD3+CD38+, CD3+CD16+CD56+, CD3−CD16+CD56+, CD19+, CD8+CD28+, CD8+CD28−.

Цитотоксическая активность естественных киллеров (ЕК-клеток) определена с помощью полуавтоматического колориметрического МТТ-теста в отношении клеток К-562 [17].

Для статистической обработки результатов использован пакет статистических программ «Статистика.7». Различия между средними значениями показателей определены с помощью U-критерия Манна–Уитни и t-критерия Стьюдента. Для определения связи между изучаемыми признаками использован непараметрический корреляционный анализ Спирмена. Различия между показателями считали статистически значимыми при р≤0,05. Результаты представлены в виде среднего арифметического значения показателя±стандартное отклонение (m±s).

Результаты и обсуждение

До лечения у 10 из 21 (47,6%) больного ДМК было снижено количество CD3+-Т-лимфоцитов (55,9±3,9%) по сравнению с контролем (72,96±4,9%; p=0,0000) и с группой с их нормальным показателем (77,9±4,9%; p=0,0001). В то же время у той же группы больных отмечено значительное повышение исходного количества CD3‒CD16+CD56+ ЕК-клеток (24,0±5,1% против 16,9±6,5% в контрольной группе; p=0,004), а также снижение количества CD8+-Т-лимфоцитов, экспрессирующих коактивационный рецептор CD28 (5,4±3,0 против 11,9±5,5% в контрольной группе; р=0,0006) и величины соотношения CD8+CD28+/CD8+CD28− (0,36±0,13 против 1,04 в контрольной группе; 1,04 р=0,009). После 2–4 недель введения Рефнота сниженное количество CD3+-клеток отмечено у 7 (33,3%) из 21 больного. Перед 2-м курсом лечения обследование было проведено 11 пациентам, и сниженное по сравнению с нормой количество CD3+-Т-клеток выявлено лишь у 1 (9,1%) больного.

После 2–4 недель терапии Рефнотом у 4 из 10 пациентов со сниженным до лечения количеством CD3+-Т-клеток отмечена нормализация основных показателей иммунитета. Так, процент CD3+-Т-клеток повысился до контрольного уровня (с 59,0±3,3 до 71,4±0,6%; p=0,0003), возросло и количество CD3+CD4+ (с 36,7±4,4 до 43,6±3,4%; р=0,048) и сниженное до лечения число CD3+CD8+ Т-лимфоцитов. Повышенный у этих пациентов до лечения процент CD3‒CD16+CD56+ ЕК-клеток (23,7±5,1%) по сравнению как с группой с исходно нормальными значениями CD3+, так и с контролем (10,7±5,7%; p = 0,0006; 16,9±6,5%; p = 0,004, соответственно) после 2–4 недель терапии Рефнотом снизился до уровня контроля. В то же время на фоне снижения количества ЕК-клеток отмечена тенденция к повышению их цитотоксической активности (см. таблицу). Следует отметить, что у этих больных также повысилось сниженное по сравнению с контролем количество CD8+CD28+ Т-лимфоцитов и, соответственно, практически в 2 раза возросло соотношение CD8+CD28+/CD8+CD28−. И до и после терапии Рефнотом у данной группы больных количество активированных Т-клеток (CD3+HLA-DR+) превышало контрольные значения. У остальных 6 из 10 пациентов со сниженным до лечения количеством CD3+-

Т-лимфоцитов отмечено уменьшение основных показателей Т-клеточного звена иммунитета (включая CD8+CD28+-Т-клетки и величину соотношения CD8+CD28+/CD8+CD28−), однако происходило дальнейшее возрастание количества CD3‒CD16+CD56+-ЕК-клеток (до 36,8±11,2%), которое было повышено и до лечения. Повышение количества ЕК-клеток на фоне снижения числа CD3+-Т-клеток, по-видимому, носило компенсаторный характер. Непараметрический корреляционный анализ Спирмена выявил статистически значимую сильную обратную корреляционную связь между количеством CD3+-Т-лимфоцитов и CD3‒CD16+CD56+-ЕК-клеток (коэффициент корреляции r=-0,853; p=0,0000) у всех пациентов, включенных в исследование. У 11 пациентов с исходно нормальным количеством CD3+-Т-лимфоцитов было повышено по сравнению с контролем (9,6±6,2%) количество ЕК-клеток (ЕК-клетки – CD3+CD16+CD56+) как до лечения (16,3±11,2%; p=0,32), так и после терапии Рефнотом (16,5±11,4%; p=0,033). В данной группе терапия Рефнотом больных приводила к нормализации сниженного до лечения по сравнению с контролем (10,6±5,7%; p=0,006) количества ЕК-клеток. И до и после введения Рефнота отмечено сниженное по сравнению с контролем процентное содержание CD8+CD28+-Т-клеток, однако статистически значимого отличия величины соотношения CD8+CD28+/CD8+CD28− от контроля не наблюдалось.

Результаты определения основных показателей иммунитета у 11 пациентов до лечения, после 2–4 недель терапии Рефнотом и перед 2-м курсом иммунохимиотерапии представлены на рис. 1 и 2 (a, б). Как следует из рис. 1 и 2 (a), в процессе химиоиммунотерапии наблюдалась тенденция к нормализации некоторых показателей иммунореактивности пациентов: количества CD3+, CD3+CD8+ и CD8+CD28+ Т-клеток. Количество ЕК-клеток (CD3‒CD16+CD56+) перед 2-м курсом химиоиммунотерапии снижалось после некоторого повышения практически до уровня контроля, в то же время отмечена тенденция к постепенному возрастанию цитотоксической активности этих клеток. Это может указывать на повышение цитотоксического потенциала естественных киллеров под влиянием химиоиммунотерапии с включением Рефнота. Следует отметить, что перед 2-м курсом терапии нормализовалась величина соотношения CD8+CD28+/CD8+CD28− в среднем c 0,67 до 1,11 (в контроле – 1,04) (рис. 2б).

В проведенном ранее в нашей лаборатории исследовании влияния Рефнота на основные показатели иммунитета у пациентов с ДМК, диссеминированным раком толстого кишечника и другими злокачественными опухолями, с использованием однопараметрового цитометрического анализа было продемонстрировано, что Рефнот повышает количество CD3+, CD4+, CD8+ Т-клеток, сниженное до лечения, а также повышает цитотоксический потенциал ЕК-клеток [18]. Использование в настоящем исследовании для иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови пациентов с ДМК, получавших Рефнот в сочетании с химиотерапией, многопараметрового цитометрического анализа позволило более четко определить популяции лимфоцитов, на которые положительно влияет препарат. Продемонстрировано положительное воздействие Рефнота одного и в сочетании с химиотерапией на субпопуляции лимфоцитов, играющих основную роль в противоопухолевом иммунитете. Отмечена тенденция к повышению у части больных сниженного количества CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, нормализация количества ЕК-клеток и повышение их цитотоксической активности. Следует отметить, что проводимое лечение вызывало повышение сниженного до лечения количества CD8+CD28+-Т-клеток, экспрессирующих костимуляторный рецептор CD28, и величины соотношения CD8+CD28+/CD8+CD28−. CD28 является наиболее важным костимуляторным рецептором Т-лимфоцитов, передача сигнала с которого необходима для эффективной активации Т-клеток через Т-клеточный рецептор, их пролиферации и продукции цитокинов, и снижение величины соотношения CD8+CD28+/CD8+CD28− при определенных патологических состояниях может являться неблагоприятным прогностическим фактором [19, 20].

Хорошо известно, что у подавляющего большинства онкологических больных, особенно при значительном распространении заболевания, обнаруживаются определенные нарушения иммунологической реактивности и проводимая иммунотерапия не всегда способна индуцировать эффективный противоопухолевый иммунный ответ. Полученные в настоящем исследовании результаты подтвердили способность Рефнота оказывать положительное воздействие на основные показатели противоопухолевого иммунитета у онкологических больных с поздними стадиями заболевания.


Literature


  1. Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L., Green S., Fiore N., Williamson B. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975;72:3666–70.
  2. Pennica D., Nedwin G.E., Hayflick J.S., Seeburg P.H., Derynck R., Palladino M.A., Kohr W.J., Aggarwal B.B., Goeddel D.V. Human tumour necrosis factor: precursor structure, expression and homology to lymphotoxin. Nature. 1984;312:724–29.
  3. Wang X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 2001;15:2922–33.
  4. Petersen S.L., Wang L., Yalcin-Chin A., Li L., Peyton M., Minna J., Harran P., Wang X. Autocrine TNF alpha signaling renders human cancer cells susceptible to Smac-mimetic-induced apoptosis. Cancer Cell. 2007;12:45–56.
  5. Wang X., Lin Y. Tumor necrosis factor and cancer, buddies or foes? Acta Pharmacol. Sin. 2008;29(11):1275–88.
  6. Славина Е.Г., Бигвава Х.А., Заботина Т.Н., Борунова Т.Н., Морозова Л.Ф., Черт-кова А.И., Нуртдинова В.А., Кадагидзе З.Г. Модификация фактором некроза опухоли (ФНО-α) цитотоксического и апоптотического действия противо-опухолевых лекарств в клетках меланомы человека. Российский биотерапевтический журнал. 2009;8(4):37–44.
  7. Alexander H.R.Jr, Bartlett D.L., Libutti S.K., Pingpank J.F., Fraker D.L., Royal R., Stein-berg S.M., Helsabeck C.B., Beresneva T.H. Analysis of factors associated with outcome in patients undergoing isolated hepatic perfusion for unresectable liver metastases from colorectal center. Ann. Surg. Oncol. 2009;16(7):1852–59.
  8. Tracey K.J., Beutler B., Lowry S.F., Merryweather J., Wolpe S., Milsark I.W., Hariri R.J., Fahey T.J., Zentella A., Albert J.D. Shock and tissue injury induced by recombinant human cachectin. Science. 1986;234:470–74.
  9. Tracey K.J., Wei H., Manogue K.R., Fong Y., Hesse D.G., Nguyen H.T., Kuo G.C., Beutler B., Cotran R.S., Cerami A., Lowry S.F. Cachectin/tumor necrosis factor induces cachexia, anemia, and inflammation. J. Exp. Med. 1988;167:1211–27.
  10. Grünhagen D.J., de Wilt J.H., van Geel A.N., Verhoef C., Eggermont A.M. Isolated limb perfusion with TNF-α and melphalan in locally advanced soft tissue sarcomas of the extremities. Recent Results Cancer Res. 2009;179:257–70.
  11. Deroose J.P., Grünhagen D.J., van Geel A.N., de Wilt J.H., Eggermont A.M., Verhoef C. Long-term outcome of isolated limb perfusion with tumour necrosis factor-α for patients with melanoma in-transit metastases. Br. J. Surg. 2011;98:1573–80.
  12. Goldstein, A.L., Guha A., Zatz M.M., Hardy M.A, White A. Purification and biological activity of thymosin, a hormone of the thymus gland. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1972;69:1800–03.
  13. Romani L., MorettiS., FallarinoF., Bozza S., Ruggeri L., Casagrande A., Aversa F., Bistoni F., Velardi A., Garaci E. Jack of all trades: thymosin α1 and its pleiotropy. Ann. N.Y. Acad. Sci.2012;1269:1–6.
  14. King R.S., Tuthill C. Evaluation of thymosin alpha 1 (Ta1) in nonclinical models of the immune-suppressing indications melanoma and sepsis. Expert. Opin. Biol. Ther. 2015;2:1–9.
  15. Maio M., Mackiewicz A., Testori A., Trefzer U., Ferraresi V., Jassem J., Garbe C., Lesimple T., Guillot B., Gascon P., Gilde K., Camerini R., Cognetti F. Thymosin Melanoma Investigation Group. Large randomized study of thymosin alpha 1, interferon alfa, or both in combination with dacarbazine in patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 2010;28(10):178–87.
  16. Garaci E., Favalli C., Pica F., Sinibaldi Vallebona P.,Palamara A.T., Matteucci C., Pierimarchi P., Serafino A., Mastino A., Bistoni F., Romani L., Rasi G. Thymosin alpha 1: from bench to bedside. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007;1112:225–34.
  17. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assayю J. Immunol. Meth. 1983;65:55–63.
  18. Кадгидзе З.Г., Славина Е.Г., Абрамов М.Е., Вышинская Г.В., Даренская А.Д. Новый иммуномодулятор Рефнот в лечении онкологических больных. Фарматека. 2013;8:71–74.
  19. Dai S.X., Wu G., Zou Y. Feng Y.L., Liu H.B., Feng J.S., Chi H.G., Lv R.X., Zheng X.B. Balance of CD8+CD28+/CD8+CD28-T lymphocytes is vital for patients with ulcerative colitis. Dig. Dis. Sci. 2013;58:88–96.
  20. Li X., Kong H., Tian L., Zhu Q., Wang Y., Dong Y., Ni Q., Chen Y. Changes of costimulatory molecule CD28 on circulating CD8+ T cells correlate with disease pathogenesis of chronic hepatitis B. Biomed. Res. Int. 2014; 2014:423181.


About the Autors


Z.G .Kadagidze – Doctor of Medical Sciences, Head of the centralized clinical laboratory department FSBIS RORC n.a. N.N. Blokhin, Moscow; tel. 8 (499) 324-94-74, e-mail: kad-zaira@yandex.ru
E.G. Slavina - Doctor of Medical Sciences, leading researcher at the Laboratory of Clinical Immunology of Tumors SRI of Clinical Oncology FSBIS RORC n.a. N.N. Blokhin, Moscow
A.I. Chertkova - PhD in Medical Sciences, Senior Researcher at the Laboratory of Clinical Immunology of Tumors SRI of Clinical Oncology FSBIS RORC n.a. N.N. Blokhin, Moscow
M.E. Abramov - PhD in Medical Sciences, Senior Researcher at the Department of Chemotherapy and Combined Treatment of Malignant Tumors SRI of Clinical Oncology FSBIS RORC n.a. N.N. Blokhin, Moscow


Similar Articles


Бионика Медиа