CYTOKINE STATUS AND EFFICIENCY OF CYTOKINE THERAPY OF ROTAVIRUS INFECTION IN CHILDREN


L.N. Mazankova (1), T.A. Chebotareva (1), I.D. Maykova (2), S.G. Gorbunov (1)

(1) SBEI FPE "Russian Medical Academy of Postgraduate Education" of RMPH, Moscow; (2) SBHCI "Tushino City Children's Hospital" Moscow Healthcare Department
The article describes the changes in the cellular and humoral immunity in acute intestinal infections of various etiologies, including rotavirus infection, detected during examination of 145 children aged 5 months to 14 years; the correlation between the degree of immunological disorders and clinical features of the disease in childhood were identified. The most significant changes in cytokine status are associated with increased interleukin -1β levels, which is a marker of intoxication. Additionally, rotavirus infection in children reduces the induced interferons-α and -γ levels, that justifies the use of interferon α-2b, contained in drug Viferon. Along with basic therapy, inclusion of Viferon and probiotic Bifiform Kid in complex treatment for children with rotavirus allows to improve the dynamics of clinical and immunological parameters, as well as reduce by 1.5 times the number of cases of SARS during the 6 months follow-up after the acute period of the disease.

Ротавирусная инфекция (РВИ) считается наиболее частой причиной диареи в детском возрасте. По оценкам экспертов ВОЗ, практически каждый ребенок в течение первых трех–пяти лет жизни переносит РВИ независимо от расы и социально-экономического статуса [1]. Актуальность данной проблемы определяется не только чрезвычайно широкой распространенностью ротавируса в популяции, но и довольно тяжелым течением заболевания с развитием эксикоза различной степени, нарушений ферментации углеводов, дисбиоза кишечника, высоким риском осложнений (гиповолемический шок, поражение ЦНС и др.), а также возможностью внутрибольничного инфицирования, что приводит к ухудшению состояния больного и увеличению сроков его госпитализации.

Основные патогенетические механизмы развития осмотической диареи при РВИ в настоящее время хорошо известны: прямое цитопатическое действие ротавируса на энтероциты, влияние энтеротоксина, вторичная дисахаридазная (главным образом лактазная) недостаточность и нарушение функций индигенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), в первую очередь касающихся синтеза короткоцепочечных летучих жирных кислот [2]. Однако недостаточно изученным остается действие ротавируса на иммунную систему, что может иметь значение в отношении последующего формирования внекишечных проявлений заболевания, хронизации инфекции, ее рецидивов, а также являться триггером возникновения аутоиммунного поражения ЖКТ. В свою очередь определение особенностей иммуногенеза РВИ позволит теоретически обосновать возможность назначения иммунопрепаратов для лечения детей с этим заболеванием.

Так, например, известно, что при острых кишечных инфекциях (ОКИ) бактериальной этиологии иммунологические сдвиги характеризуются снижением фагоцитарной активности нейтрофилов и уменьшением содержания общего IgM в сыворотке крови [3]; при иерсиниозе отмечается дефицит CD3- и CD4-лимфоцитов с повышением содержания CD8-субпопуляции [4]; при ОКИ, вызванных условно-патогенной флорой, наблюдается снижение количества иммунорегуляторных клеток и IgG с одновременным увеличением уровня IgM [5]. Все ОКИ независимо от этиологии заболевания, как правило, протекают на фоне местной иммуносупрессии и дефицита IgAs, который связывается с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами как вирусного, так и бактериального происхождения и препятствует их адгезии на эпителиоцитах кишечника [6].

Особенности функционирования иммунной системы в детском возрасте не позволяют в должной мере защищать слизистую оболочку ЖКТ и организм ребенка в целом от воздействия патогенных микроорганизмов. Доказано, что на протяжении нескольких лет после рождения иммунитет остается несовершенным: у детей количество плазмоцитов, синтезирующих IgAs, приближается к аналогичному показателю взрослых только ко второму году жизни, а содержание мукозального IgA – лишь к 6–8 годам. Созревание иммунной системы новорожденного происходит под влиянием контактов с пищевыми и бактериальными антигенами, в т.ч. с антигенами нормальной индигенной микрофлоры ЖКТ, обладающими иммуномодулирующим действием [7].

Между состоянием иммунитета и микробным пейзажем существует тесная взаимосвязь, что подтверждается соответствующими лабораторными исследованиями и согласуется с клиническими данными. Бифидобактерии и лактобациллы способствуют синтезу таких факторов иммунной защиты, как лизоцим, пропердин, комплемент, IgAs, активируют фагоцитоз, системы цитокинов и интерферонов [8]. Установлено, что при дисбактериозе I–II степеней происходит активация местного иммунитета (повышается уровень IgA и лизоцима в копрофильтратах), тогда как при дисбиозе III степени эти иммунные механизмы истощаются, а также снижается концентрация общих IgA и IgG в сыворотке крови, угнетается фагоцитарная активность лейкоцитов.

Для коррекции указанных иммунологических нарушений при ОКИ вирусной этиологии наряду с пробиотиками представляется целесообразным использование препаратов интерферона, которые оказывают иммуномодулирующее и противовирусное действия, положительно влияют на динамику клинических проявлений заболевания [9]. Одним из широко применяемых препаратов данной группы в настоящее время является Виферон – рекомбинантный интерферон-α-2b, выпускаемый в виде ректальных суппозиториев, что удобно для применения в детской практике.

Исходя из изложенного, целью настоящей работы стало определение особенностей иммунного статуса и эффективности иммунотерапии при РВИ у детей.

Материал и методы исследования

Работа проведена на базе 4-го инфекционного отделения ГБУЗ «Тушинская ДГБ» ДЗ Москвы (главный врач – проф. И.М. Османов). Были обследованы 145 детей в возрасте от 5 месяцев до 14 лет с ОКИ, протекающими по типу водянистой диареи. Из них детей первого года жизни было 10,3%, в возрасте 1–3 лет – 29,0%, старше 3 лет – 60,7%; мальчиков – 74 (51%), девочек – 71 (49%). Все пациенты были госпитализированы в первые-вторые сутки от начала заболевания, в анамнезе у них отсутствовали пищевая аллергия, лактазная недостаточность, а также факт приема пробиотиков и иммуномодуляторов непосредственно перед настоящим эпизодом ОКИ.

Всем детям проведено общеклиническое обследование, включившее сбор жалоб и анамнеза, осмотр в динамике, исследование крови и мочи, биохимический анализ крови, бактериологический посев кала на кишечную группу, копрограмму, по показаниям – ультразвуковое исследование органов брюшной полости, консультацию хирурга для исключения «острого живота». Кроме того, с целью этиологической расшифровки заболевания методом иммуноферментного анализа (ИФА) определен антиген ротавируса в кале всех пациентов на базе бактериологической лаборатории Тушинской ДГБ, а также РНК рота-, норо- и астровирусов в копрофильтратах методом полимеразной цепной реакции на базе ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Иммунологическое обследование всем детям проведено на 1–2-й и 5–6-й дни госпитализации с целью динамического мониторинга за состоянием иммунного статуса. Исследования выполнены на базе лаборатории онтогенеза и коррекции системы интерфероногенеза ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН и в Центре иммунокоррекции ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздрава России.

В сыворотке крови больных методом ИФА с помощью тест-систем производства «Biosourse» (Бельгия) и «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург, Россия) определено содержание провоспалительных цитокинов (интерлейкинов [ИЛ]-1β, -6 и -8, фактора некроза опухоли-α, интерферонов-α и -γ) и способность к продукции иммунокомпетентными клетками интерферонов-α и -γ in vitro. Исследованы также параметры фагоцитарной активности нейтрофилов (фагоцитарное число и фагоцитарный индекс) по методу Р.В. Петрова с использованием убитой взвеси Staphylococcus aureus, уровень общих иммуноглобулинов (Ig) A, M, G в сыворотке крови по методу G. Manchini и концентрация IgA в копрофильтратах методом радиальной иммунодиффузии.

Все пациенты получали стандартное лечение пероральными регидратационными растворами, энтеросорбентами, ферментными препаратами в возрастных дозах, при необходимости проводилась инфузионная терапия глюкозо-солевыми растворами, назначались жаропонижающие средства. Дополнительно к базисному лечению 33 ребенка (1-я группа) получали пробиотик Бифиформ Малыш (Ферросан, Дания), содержащий штаммы ВВ12 и LGG в возрастных дозах в течение 5 дней; 34 детям (2-я группа) вводили ректально Виферон, основным действующим веществом которого является интерферон-α-2b, по 1 свече дважды в день курсом 5 дней (в возрасте до 7 лет по 150 тыс. МЕ, старше 7 лет – по 500 тыс. МЕ); 35 пациентов (3-я группа) получали комбинированное лечение Бифиформом Малыш и Вифероном; 43 ребенка составили контрольную, 4-ю, группу, которым назначалась только базисная терапия. Группы формировались методом случайной выборки и оказались сопоставимыми по возрасту, степени тяжести заболевания, типу диареи и топике поражения ЖКТ.

Статистическая обработка полученных результатов проведена с помощью пакета программ «Statistica 6.1» с использованием параметрического t-критерия Стьюдента и непараметрических критериев Вилкоксона, Уитни–Манна и Фишера.

Результаты и их обсуждение

Этиологию ОКИ удалось установить в отношении 81,4% больных, в т.ч. для 53,8% детей причиной заболевания оказался ротавирус, для 9,7% – норовирус, для 3,4% – астровирус; в 9,7% случаев зарегистрирована микст-вирусная инфекция и для 4,8 % пациентов причиной ОКИ был сальмонеллез. Диарея осмотического типа отмечена у 109 (75,2%) детей, секреторного – у 13 (8,9 %), инвазивного – у 12 (8,3%), а у 11 (7,6%) пациентов заболевание протекало без диареи. По топике поражения ЖКТ чаще всего регистрировался гастроэнтерит – 76,6%.

ОКИ протекала в легкой форме у 9 (6,2%) больных, в среднетяжелой – у 119 (82,1 %), в тяжелой – у 17 (11,7%).

Длительность лихорадки оказалась достоверно менее продолжительной при легком течении заболевания по сравнению со среднетяжелыми и тяжелыми формами: 1,22±0,83, 2,32±1,18 и 3,17±1,07 суток соответственно (р<0,05 по t-критерию Стьюдента). Рвота также была менее продолжительной у больных с легким течением относительно пациентов с тяжелым течением ОКИ: 1,22±0,66 против 2,05±0,96 суток (р<0,05). Диарея длилась достоверно меньше при легких формах заболевания по сравнению со среднетяжелыми и тяжелыми: 2,0±1,0, 3,68±1,62 и 4,64±1,27 суток соответственно (р<0,01). Метеоризм наблюдался при осмотическом типе диареи у 85,3% детей, при секреторном – у 69,2%, при инвазивном – у 75,0%, тогда как в отсутствие диарейного синдрома он встречался лишь у 27,7% больных.

Токсикоз с эксикозом различной степени развивался у 79,8% детей с осмотической диареей, у 76,9% – с секреторной, у 83,3% – с инвазивной диареей и только у 54,6% пациентов без диареи. В зависимости от топики поражения ЖКТ токсикоз с эксикозом чаще (в 75–80% случаев) отмечался при гастроэнтеритах, энтероколитах и гастроэнтероколитах, тогда как при гастритах обезвоживание наблюдалось реже (у 55% больных). В целом длительность эпизода ОКИ при легком течении составила в среднем 3,55±0,72 суток, что достоверно короче относительно среднетяжелых и тяжелых форм: 5,18±1,3 и 6,23±1,09 суток соответственно (р<0,001 по t-критерию Стьюдента). Среди всех клинических форм достоверно наименее продолжительным оказалось течениегастрита (3,8±0,6 суток) по сравнению с другими топическими диагнозами «гастроэнтерит», «энтероколит» и «гастроэнтероколитом»: 5,2±1,3, 6,0±2,0 и 5,7±1,1 суток соответственно (р<0,05).

Результаты проведенных иммунологических исследований показали, что в остром периоде ОКИ независимо от типа диареи в сыворотке крови у 70,6% больных снижался уровень IgA в среднем до 0,71±0,45 г/л (норма – 0,93± 0,3 г/л) и у 94,1 % пациентов повышался уровень IgМ в среднем до 1,3±0,74 г/л (норма – 0,56±0,2 г/л), тогда как содержание IgG у 94,1% детей оставалось в пределах нормальных значений и составило в среднем 8,55±2,99 г/л. Указанные изменения свидетельствуют об активации гуморального звена иммунитета в остром периоде заболевания в ответ на антигенную стимуляцию. В период ранней реконвалесценции наблюдалось спонтанное повышение концентрации IgA в сыворотке крови всех пациентов в среднем до 1,09±0,63 г/л при сохранении высокой концентрации IgМ и нормальной концентрации IgG (табл. 1).

Эти изменения коррелировали со снижением уровня IgAs в копрофильтратах – с 0,58 до 0,42 мг/мл, что отражает процесс купирования местной воспалительной реакции в кишечнике на фоне формирования гуморального иммунного ответа.

У 77,8% детей выявлено снижение фагоцитарного индекса в среднем до 40% при норме 50–70% и у 100% больных – снижение фагоцитарного числа до 3 микробных тел при норме 4–7. При РВИ дефицит фагоцитоза коррелирует со слабой системной продукцией интерферонов-α и -γ, что, вероятно, обусловлено иммуносупрессивным действием ротавируса в остром периоде заболевания [10]. В динамике у 72,8% пациентов фагоцитарный индекс в среднем достигал нижних значений нормы (49,5%), тогда как фагоцитарное число сохранялось на низком уровне – 3,1 (табл. 1). Подобные изменения свидетельствуют о дефиците клеточного звена иммунитета.

При исследовании цитокинового статуса анализировалась продукция провоспалительных ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, фактора некроза опухоли-α, являющихся медиаторами клеточного звена иммунитета, а также интерферонов-α и -γ – спонтанных и индуцированных. Показано, что в остром периоде РВИ отмечено повышение содержания в сыворотке крови ИЛ-1β и ИЛ-6 до 272,18 и 86,9 пкг/мл соответственно, тогда как содержание ИЛ-8 и фактора некроза опухоли-α не превышало ординарных значений – 27,7 и 32,0 пкг/мл соответственно (норма для всех показателей – до 50 пкг/мл). В период ранней реконвалесценции наблюдалось отсутствие существенной динамики в уровне фактора некроза опухоли-α, ИЛ-6 и -8, тогда как уровень ИЛ-1β достоверно возрастал по сравнению с острым периодом заболевания и достигал 357,85 пкг/мл (табл. 2), что отражает степень местной воспалительной реакции в ЖКТ и активацию антителообразования.

В первые-вторые сутки заболевания количество сывороточных интерферонов-α и -γ сохранялось в пределах нормы (соответственно 19,05 и 12,0 пкг/мл при норме до 50 пкг/мл), тогда как количество индуцированных интерферонов-α и -γ оказалось сниженным до 63,45 и 508,2 пкг/мл соответственно (норма – 100–500 и 1000–5000 пкг/мл), что свидетельствовало о недостаточности противовирусного иммунитета в ответ на нагрузку антигенами ротавируса [11]. При динамическом исследовании существенных изменений количества данных цитокинов не произошло: уровни сывороточных интерферонов-α и -γ не превышали нормальных значений, а содержание индуцированных интерферонов-α и -γ оставалось сниженным у 75,2 и 80,4% детей соответственно. Сохранение в период ранней реконвалесценции дефицита индуцированных интерферонов-α и -γ говорит о низком интерфероногенезе и длительности иммуносупрессии.

Поскольку наиболее выраженные нарушения из всех изучаемых иммунологических показателей отмечены со стороны ИЛ-1β, нами была проанализирована клиническая картина РВИ у детей в зависимости от уровня этого цитокина (табл. 3). У больных с высоким уровнем ИЛ-1β достоверно чаще наблюдались рвота (6–10 раз/сут) и токсикоз с эксикозом II степени – 30 против 11,6% и 30 против 9,3% соответственно (р<0,05 по критерию Фишера), что позволяет рассматривать данный цитокин в качестве маркера синдрома интоксикации в остром периоде РВИ. Подтверждает этот факт то обстоятельство, что высокий уровень ИЛ-1β выявлен у пациентов всех возрастных групп и при любом течении заболевания, однако степень его повышения оказалась при этом разной. Так, у детей в возрасте старше 7 лет диапазон уровня ИЛ-1β в сыворотке крови был значительно шире, чем у детей младшего возраста, и колебался в пределах 123–2073 пкг/мл. При легком течении РВИ уровень данного цитокина повышался в 2–4 раза выше нормы (в среднем 201,56 пкг/мл), при среднетяжелом течении – в 4–6 (в среднем 304,27 пкг/мл) и при тяжелом течении – в 6–8 раз (в среднем 406,97 пкг/мл).

Выявленные отклонения в цитокиновом статусе у детей с РВИ послужили обоснованием включения иммунотерапии в комплекс лечебных мероприятий при данной нозологии. У детей 1-й группы, получавших Бифиформ Малыш, достоверных различий в выраженности и длительности различных симптомов заболевания не наблюдалось, однако было отмечено положительное влияние этого пробиотика на показатели иммунитета: достоверно повышались фагоцитарный индекс, фагоцитарное число и уровень сывороточного IgA (р<0,05 по t-критерию Стьюдента). Уровень IgМ в сыворотке крови хотя и оставался повышенным, но был достоверно ниже аналогичного показателя в контрольной группе.

У пациентов 2-й группы, находившихся на базисной терапии в сочетании с Вифероном, достоверно быстрее купировались симптомы интоксикации по сравнению с 4-й (контрольной) группой (р<0,05 по t-критерию Стьюдента). При этом в 2 раза нарастало содержание интерферонов-α и -γ у 37,5 и 46,1% больных соответственно, что превосходило показатели контрольной группы, хотя эти различия не были достоверными, что объясняется низкой интерфероногенной активностью ротавируса в остром периоде заболевания [11].

У детей 3-й группы, получавших наряду с базисным лечением Бифиформ Малыш и Виферон, как и во 2-й группе, зарегистрировано достоверное ослабление симптомов интоксикации относительно контроля, а также отмечена положительная динамика иммунологических показателей: снижение уровня провоспалительного цитокина ИЛ-6 и повышение содержания индуцированного интерферона-γ до нормы у 66,7% пациентов по сравнению с 4-й группой (р<0,001).

Длительность заболевания во всех группах составила в среднем 5 суток, таким образом, существенного влияния ни один из изучаемых способов лечения на продолжительность РВИ у детей не оказывал. Однако, несмотря на клиническое выздоровление к этому сроку, полной нормализации показателей клеточно-опосредованного противовирусного иммунитета и интерфероногенеза не происходит. Катамнестическое наблюдение в течение 6 месяцев за 74 пациентами, перенесшими РВИ, показало, что дети, получавшие в остром периоде Виферон и комбинацию Виферона с Бифиформом Малыш в отличие от пациентов, находившихся лишь на базисной терапии или лечившихся по стандарту в сочетании с пробиотиком, в 1,5 раза реже болели острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ; см. рисунок). При этом заболевание у них протекало в легкой и среднетяжелой формах: соответственно у 53,2 и 46,8% детей.

Выводы

Острый период ОКИ независимо от типа диареи характеризуется активацией гуморального звена иммунитета в ответ на антигенную стимуляцию, что выражается в снижении уровня сывороточного IgA и повышении уровня IgМ, а также дефиците клеточного звена иммунитета, проявляющемся снижением показателей фагоцитоза.

В период ранней реконвалесценции ОКИ при повышении в сыворотке крови концентрации IgA и сохранении высокой концентрации IgМ снижается уровень IgAs, что свидетельствует о купировании местной воспалительной реакции в кишечнике на фоне формирования гуморального иммунного ответа.

Из всех провоспалительных цитокинов как в остром периоде заболевания, так и период ранней реконвалесценции наиболее выраженное повышение содержания отмечается для ИЛ-1β, что может рассматриваться как маркер синдрома интоксикации в остром периоде РВИ.

Иммуносупрессивное действие ротавируса подтверждается снижением уровня индуцированных интерферонов-α и -γ на протяжении всего течения инфекции, что служит обоснованием включения иммунотерапии в комплекс терапевтических мероприятий для больных РВИ.

Применение пациентами с РВИ наряду с базисным лечением Виферона, содержащего интерферон-α-2b, и комбинации Виферона с пробиотиком Бифиформ Малыш способствует положительной клинико-иммунологической динамике в остром периоде заболевания, а также в 1,5 раза снижает частоту ОРВИ у детей при катамнестическом наб-людении в течение 6 месяцев.


Literature


  1. Implementing the new recommendations on the clinical management of diarrhoea: guidelines for policy makers and programme managers. WHO, 2006. 36 р.
  2. Мазанкова Л.Н., Горбунов С.Г. Ротавирусная инфекция у детей: клиника, лечение и вакционопрофилактика (учебно-методическое пособие). М., 2014. 33 с.
  3. Мартынова Г.П. Клинико-иммунологические нарушения при кишечных инфекциях у детей и методы их коррекции. Дисс. докт. мед. наук. Красноярск, 2003. 48 с.
  4. Пшенисова А.С., Дарджания Р.А. Характеристика иммунного статуса при эшерихиозной инфекции у детей. Материалы II Конгресса педиатров-инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей». М., 2003. С. 161–62.
  5. Чащина Е.С., Карпова Н.В., Калугина Т.В. Малявина Т.Е., Ахметова Л.И. Микрофлора кишечника и иммунологические показатели в крови у детей, перенесших острый инфекционный энтероколит. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1997;1:87–8.
  6. Тихомирова О.В., Сергеева Н.В., Сироткин А.К. Вирусные диареи у детей: особенности клинического течения и тактика терапии. Детские инфекции. 2003;3:7–11.
  7. Кафарская Л.И., Ефимов Б.А., Постникова Е.А., Донских Е.Е. Особенности становления микрофлоры у детей раннего возраста. Детские инфекции. 2006;1:6–12.
  8. Мазанкова Л.Н., Новокшонов А.А., Майкова И.Д. Микробиоценоз кишечника и иммунитет. Детские инфекции. 2007;1:9–12.
  9. Малиновская В.В. Новый комплексный препарат Виферон и его применение в иммунореабилитации в педиатрической и акушерской практике. Internat. J. Immunorehabilit. 1998;10:76–84.
  10. Виферон: комплексный противовирусный и иммуномодулирующий препарат для детей и взрослых (руководство для врачей под ред. В.В. Малиновской). М., 2006. 87 с.
  11. Майкова И.Д. Особенности иммунного статуса и иммунокорригирующая терапия при острых кишечных инфекциях у детей. Дисс. канд. мед. наук. М., 2008. 24 с.


About the Autors


L.N. Mazankova – MD, Prof., Head of the Department of Pediatric Infectious Diseases SBEI FPE RMAPE of RMPH; e-mail: mazankova@list.ru
T.A. Chebotareva – MD, Prof. at the Department of Pediatric Infectious Diseases SBEI FPE RMAPE of RMPH; e-mail: t_sheina@mail.ru
I.D. Maikova – PhD in Medical Sciences, Deputy Chief Physician for infectious diseases SBHCI "Tushino City Children's Hospital" Moscow Healthcare Department
S.G. Gorbunov- MD, Assistant Professor at the Department of Pediatric Infectious Diseases SBEI FPE RMAPE of RMPH; e-mail: gsgsg70@mail.ru


Similar Articles


Бионика Медиа