Бесплодие неясного генеза (БНГ) занимает особое положение в репродуктивной медицине. Этот диагноз устанавливается после исключения основных известных причин бесплодия: овуляторного, трубно-перитонеального, маточного и выраженного мужского фактора [1, 2]. По данным ESHRE (2023), доля БНГ в структуре бесплодия достигает 30% и снижается при расширенном обследовании [2].
Согласно руководству ESHRE (2023), БНГ является диагнозом исключения [2]. В документе приведено определение ICMART, согласно которому БНГ устанавливается у пар с нормальной функцией яичников, маточных труб, матки, шейки матки и органов малого таза, адекватной частотой половых контактов, а также с нормальной мужской репродуктивной функцией и нормальным эякулятом [2, 3]. При этом ESHRE подчеркивает, что частота постановки такого диагноза зависит от объема выполненного обследования и доступных диагностических методов [2].
Одним из возможных факторов неэффективных программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) у пар с БНГ является анеуплоидия эмбрионов [4]. В клинической практике преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ПГТ-А) рекомендуется пациентам старшего репродуктивного возраста, при повторных репродуктивных потерях (привычном выкидыше), повторных неудачах имплантации, тяжелых нарушениях сперматогенеза, а также в отдельных ситуациях, когда предполагается повышенный риск получения анеуплоидных эмбрионов [5, 6–8]. Вместе с тем доказательная база для рутинного применения ПГТ-А с целью повышения эффективности программ ВРТ остается неоднородной: клинический результат зависит от возраста пациентки, числа полученных бластоцист, прогноза лечения и конечной точки анализа на перенос или на цикл [5, 9–12].
Современные рекомендации сохраняют неоднозначную позицию в отношении применения ПГТ-А при БНГ. Российские клинические рекомендации по женскому бесплодию не выделяют БНГ как самостоятельное показание к ПГТ-А [4]. В заключении ASRM 2024 г. указано, что ПГТ-А не рекомендуется в качестве универсального скринингового теста для всех пациенток ВРТ, поскольку его ценность как рутинного скрининга не была доказана. В многоцентровых рандомизированных контролируемых исследованиях исходы беременности после переноса криоконсервированных эмбрионов были сопоставимы между группами ПГТ-А и стандартного экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), а способность ПГТ-А снижать риск ранней потери беременности остается неопределенной. Клиническая ценность метода зависит от выборки пациентов, включенных в исследование, дизайна исследования и выбранной конечной точки [5].
В отечественной литературе эмбриологический этап программ ВРТ при БНГ был подробно проанализирован Бачуриным А.В. и соавт. (2022). Авторы показали, что при БНГ могут выявляться нарушения морфологического качества сформированных бластоцист, а также ранних этапов эмбрионального развития. В этой работе ПГТ-А при БНГ выполнялось чаще, чем при трубно-перитонеальном факторе, однако частота получения эуплоидных эмбрионов существенно не различалась между двумя группами [13].
ПГТ-А выявляет только численные хромосомные нарушения эмбриона. Повторная остановка раннего эмбрионального развития встречается и при эуплоидном наборе эмбриона, что указывает на моногенные механизмы, не выявляемые методом ПГТ-А [14]. Это обосновывает отдельный анализ подгруппы пар с повторной остановкой развития методом полноэкзомного секвенирования (ПЭС).
Цель настоящего исследования: оценить эмбриологические и клинические результаты программ ВРТ у пациенток с БНГ в зависимости от применения ПГТ-А, а также проанализировать результаты ПЭС у пар с повторной остановкой раннего эмбрионального развития.
БНГ само по себе не является самостоятельным показанием к проведению ПГТ-А согласно протоколу лечения, утвержденному письмом Минздрава России от 05.03.2019 г. [15]. Обновленные клинические рекомендации по женскому бесплодию 2024 г. [4] отдельного перечня показаний к ПГТ-А также не содержат. Тем не менее в реальной клинической практике решение о применении ПГТ-А у таких пациенток нередко принимается индивидуально с учетом возраста и анамнеза, что отражает более широкую трактовку роли ПГТ-А, представленную в ряде зарубежных рекомендаций [5]. Настоящее исследование намеренно ставит целью оценку эмбриологических и клинических исходов фактического применения ПГТ-А именно в этой популяции пациенток с БНГ, вне рамок формальных показаний, поскольку именно эта область клинической неопределенности наиболее востребована в повседневной практике ВРТ.
Материалы и методы
Проведен ретроспективный анализ данных пациенток с БНГ, проходивших лечение в программах ВРТ в период с сентября 2022 г. по май 2026 г. Исследование выполнено в ФГБУ «НМИЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России на базе научно-клинического отделения вспомогательных репродуктивных технологий имени Ф. Паулсена. В анализ включали сплошную последовательную выборку пациенток, соответствующих критериям включения и исключения (рис. 1). Для каждой пациентки учитывали одну исследуемую программу ВРТ, соответствующую одной пункции ооцитов.
Группы сравнения формировали по факту применения ПГТ-А в исследуемой программе: группа без ПГТ-А и группа с применением ПГТ-А. БНГ не рассматривалось как самостоятельное формальное показание к ПГТ-А; в реальной клинической практике решение о его применении нередко принимается индивидуально, с учетом возраста пациентки, репродуктивного анамнеза и числа предыдущих программ ВРТ.
Исходную сопоставимость групп оценивали по клинико-анамнестическим, лабораторным и эмбриологическим характеристикам, потенциально связанным как с применением ПГТ-А, так и с репродуктивными исходами. Биопсия трофэктодермы выполняется на стадии бластоцисты, после фиксации числа ооцитов, зигот и бластоцист. Сравнение эмбриологических показателей между группами не зависит от факта биопсии.
Критериями включения являлись: диагноз БНГ; нормальный кариотип партнеров без структурных перестроек; отсутствие выраженного мужского фактора; отсутствие донорских ооцитов, спермы, эмбрионов; не менее 5 ооцитов в цикле. Дополнительный критерий для группы ПЭС (n=25) – повторная остановка развития в ≥2 циклах ВРТ при отсутствии других причин: хромосомных (нормальный кариотип, отсутствие перестроек у партнеров), мужского фактора, лабораторно-технических (единый протокол культивирования).
Подгруппа ПЭС (n=25) и основная выборка (n=226) формировались из разных источников. Единица анализа основной выборки – каждая пункция ооцитов. Подгруппа ПЭС отбиралась по факту направления на медико-генетическое консультирование при остановке развития в ≥2 циклах, в отдельной лабораторной базе данных.
Критериями исключения являлись: использование донорского материала; выраженный мужской фактор бесплодия, привычное невынашивание беременности (≥2 клинических выкидышей) в анамнезе, возраст мужчин старше 47 лет (рис. 1). Верхняя граница возраста мужчин (47 лет) – критерий, заданный до начала набора пациентов. Порог отражает расширение принятого в литературе понятия позднего репродуктивного возраста мужчины (40–45 лет), связанного с фрагментацией ДНК сперматозоидов, риском de novo мутаций и анеуплоидии сперматозоидов [16, 17].
В анализ клинико-анамнестических характеристик включали возраст пациентки, индекс массы тела, длительность и тип бесплодия, показатели овариального резерва, число предыдущих попыток ЭКО, потери беременности в анамнезе, протокол овариальной стимуляции и метод оплодотворения. Число предыдущих попыток ЭКО рассчитывали как номер текущей попытки ЭКО минус один.
Эмбриологические показатели включали число полученных ооцитов, число зрелых ооцитов, число зигот с нормальным оплодотворением, число бластоцист, пригодных для биопсии или криоконсервации, а также морфологические характеристики перенесенных бластоцист.
Основным клиническим исходом являлось живорождение после исследуемой пункции ооцитов, определяемое как рождение живого ребенка после любого переноса эмбрионов (свежего или криоконсервированного), полученных из данной пункции. Для каждой исследуемой программы ВРТ фиксировали один бинарный исход (да/нет). Кумулятивная частота живорождения на пункцию рассчитывалась как процент программ с положительным исходом в группе; это групповое выражение того же бинарного показателя.
Дополнительными исходами являлись выполнение хотя бы одного переноса эмбриона из исследуемой пункции ооцитов, клиническая беременность на перенос, беременность сроком ≥12 недель на перенос и потеря клинической беременности среди наступивших клинических беременностей.
Предварительный расчет объема выборки не выполнялся в связи с ретроспективным характером исследования. В анализ включали всех пациенток, соответствующих критериям включения и исключения за исследуемый период.
Оплодотворение и культивирование эмбрионов проводили в соответствии с принятыми в отделении лабораторными протоколами. Дальнейшую оценку развития эмбрионов проводили до стадии бластоцисты. Бластоцисты оценивали по степени экспансии, характеристикам внутренней клеточной массы и трофэктодермы по критериям Гарднера [6].
В группе ПГТ-А биопсию выполняли у эмбрионов, достигших стадии бластоцисты и признанных пригодными для генетического тестирования. Биопсию трофэктодермы проводили на 5-е или 6-е сутки эмбрионального развития. С помощью лазерного воздействия выполняли локальное рассечение блестящей оболочки, после чего отбирали несколько клеток трофэктодермы. Внутреннюю клеточную массу при биопсии не затрагивали. Полученный материал переносили в пробирку для последующего молекулярно-генетического анализа. После биопсии бластоцисты криоконсервировали методом витрификации до получения результата ПГТ-А.
ПГТ-А выполняли методом секвенирования нового поколения (next-generation sequencing, NGS). После полногеномной амплификации ДНК клеток трофэктодермы и приготовления библиотек с помощью набора реагентов «АнеуПГТ» (ООО «ДНК-Технология», Россия) для полногеномной амплификации (WGA) и подготовки NGS-библиотек проводили анализ численных хромосомных нарушений с использованием платформы СекВарио (ДНК-Технология). По результатам ПГТ-А эмбрионы классифицировали как эуплоидные, анеуплоидные, мозаичные или эмбрионы без информативного результата. Для оценки возрастной динамики хромосомного статуса результаты ПГТ-А анализировали в возрастных группах: ≤35 лет, 36–38 лет, 39–40 лет и 41–42 года.
Для группы с ранней остановкой эмбрионального развития было выполнено ПЭС. Биологический материал (кровь) был отобран в пробирки с ЭДТА, выделение ДНК производилось с помощью наборов ПРОБА-МЧ МАКС (ДНК-технологии) согласно протоколу производителя. Приготовление библиотек производилось с помощью комплекта реагентов для подготовки полногеномных библиотек (ДНК-технология), обогащение целевыми фрагментами – с помощью набора VAHTS Target Capture Core Exome Panel kit (Vazyme), секвенирование обогащенных фрагментов – с помощью секвенатора NovaSeq 6000. Обработка данных секвенирования проведена с использованием алгоритма, включающего выравнивание прочтений на референсную последовательность генома hg38, коллинг и фильтрацию вариантов по качеству. Для всех вариантов, прошедших фильтрацию по качеству, проведена аннотация с использованием Ensembl Variant Effect Predictor (VEP) и применением ряда алгоритмов предсказания значимости вариантов (SIFT, PolyPhen-2, SpliceAI). Для оценки популяционных частот выявленных вариантов использована база данных Genome Aggregation Database (gnomAD). Для оценки клинической релевантности выявленных вариантов использованы база данных OMIM, ClinVar, LOVD и другие специализированные базы данных (при наличии), а также литературные данные. Биологический материал хранился в лаборатории по сбору и хранению биоматериалов (биобанк) в ФГБУ «НМИЦ АГиП им. В.И. Кулакова». Интерпретация полученных данных была произведена с учетом рекомендаций ACMG для оценки клинической значимости полученных результатов. Верификация вариантов методом секвенирования по Сэнгеру не проводилась (см. «Обсуждение», ограничения).
Статистический анализ
Статистический анализ выполняли с использованием IBM SPSS Statistics 27.0. Нормальность распределения количественных переменных оценивали с помощью критерия Шапиро–Уилка. Количественные переменные представляли как среднее значение и стандартное отклонение M (SD) или как медиану и межквартильный интервал Me [Q1; Q3] в зависимости от распределения данных, категориальные переменные – как n/N (%). Для сравнения количественных показателей применяли t-критерий Стьюдента или критерий Манна–Уитни, при неравенстве дисперсий – критерий Уэлча. Для сравнения категориальных переменных использовали χ²-критерий Пирсона или точный критерий Фишера. Для четырех бинарных клинических исходов рассчитывали относительный риск (ОР) с 95% доверительным интервалом (95% ДИ); для количественных и многокатегориальных эмбриологических показателей приводили только значение p (см. ниже, «Относительный риск и отношение шансов»). Основной анализ клинических исходов проводили на пункцию ооцитов. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Обоснование размера выборки
Априорный расчет необходимого объема выборки не проводился, поскольку исследование основано на ретроспективном анализе сплошной последовательной выборки всех пациенток, соответствовавших критериям включения и исключения за фиксированный период набора; итоговый объем выборки определялся числом доступных наблюдений. Для ориентировочной ретроспективной оценки чувствительности имевшегося объема выборки при двустороннем уровне значимости α=0,05 и предполагаемой мощности 80% минимально выявленное различие в кумулятивной частоте живорождения между группами (n=122 и n=104) составляет около 19 процентных пунктов относительно базового уровня ~56% (расчет для сравнения двух независимых пропорций). Фактически наблюдавшееся различие (55,7% против 36,5%; 19,2 процентных пункта) находится на уровне этого порога, что указывает на ограниченную способность выявлять менее выраженные различия; редкие вторичные исходы, такие как потеря клинической беременности, могли остаться невыявленными ввиду еще меньшей статистической мощности для них. Ограниченный и заранее не рассчитанный объем выборки указан в числе ограничений исследования.
Первичный и вторичные клинические исходы
Основным клиническим исходом являлось живорождение после исследуемой пункции ооцитов. Для каждой исследуемой программы ВРТ, соответствующей одной пункции ооцитов, фиксировали одно значение бинарного исхода: было ли зарегистрировано хотя бы одно живорождение после переносов эмбрионов, полученных из данной пункции, включая последующие криопереносы (да/нет). Кумулятивная частота живорождения на пункцию – это доля исследуемых программ ВРТ с ответом «да» в группе; это один и тот же показатель, видимый на двух уровнях: индивидуальном (да/нет – зависимая переменная регрессионной модели) и групповом (доля в процентах). Ни логистическая регрессия, ни термин «кумулятивная частота» не подразумевают отдельной модели интенсивности событий или частоты на цикл: единицей анализа во всех случаях является одна исследуемая программа ВРТ (пункция ооцитов) с единственным бинарным исходом на эту единицу, а кумулятивная частота – доля положительных исходов среди этих единиц в пределах группы. Дополнительными исходами являлись: выполнение хотя бы одного переноса эмбриона из исследуемой пункции ооцитов, клиническая беременность на перенос, беременность сроком ≥12 недель на перенос и потеря клинической беременности среди наступивших клинических беременностей.
Относительный риск и отношение шансов
Количественные эмбриологические показатели (число ооцитов, бластоцист и др.) сравнивали t-критерием Стьюдента или критерием Манна–Уитни, категориальные показатели с более чем двумя градациями (например, метод оплодотворения) – χ²-критерием Пирсона; для этих сравнений в таблице 2 приведено только значение p, без расчета относительного риска (прочерк в столбце ОР). ОР с 95% ДИ рассчитывали отдельно для четырех бинарных клинических исходов – клинической беременности, беременности ≥12 недель, потери клинической беременности и живорождения (кумулятивная частота которого рассчитана как доля положительных исходов в группе; табл. 2, раздел «Клинические исходы»). Отношение шансов (ОШ) рассчитано как результат многофакторной регрессионной модели для живорождения (табл. 2, часть Б). ОР и ОШ не эквивалентны при частых исходах (>10%) и не сопоставляются напрямую. Основным показателем эффекта для нескорректированного сравнения групп по клиническим исходам является ОР как показатель, допускающий прямую содержательную интерпретацию («риск исхода в группе ПГТ-А в X раз ниже/выше»); ОШ используется исключительно как результат многофакторной модели, поскольку логистическая регрессия математически дает именно отношение шансов, а не относительный риск и не может рассматриваться как показатель, конкурирующий с ОР или заменяющий его в качестве основного.
Построение многофакторной регрессионной модели.
Для оценки связи применения ПГТ-А с живорождением с учетом исходных различий между группами была построена многофакторная логистическая регрессионная модель. В нее для каждой исследуемой пункции ооцитов вносилось одно значение – было ли по ее результатам получено хотя бы одно живорождение (да/нет). Кумулятивная частота живорождения – это доля исследуемых пункций ооцитов с ответом «да» в каждой группе; иными словами, регрессия и групповые проценты описывают один и тот же показатель на двух уровнях – индивидуальном (да/нет для каждой исследуемой пункции ооцитов, это и есть зависимая переменная модели) и групповом (доля в процентах). Основным независимым фактором являлось применение ПГТ-А (референс-группа без ПГТ-А).
Ковариаты для коррекции – возраст пациентки, число предыдущих попыток ЭКО и уровень антимюллерова гормона (АМГ) – были отобраны априорно, до построения модели, на основании их известной клинической значимости как предикторов исходов ВРТ [5] и результатов сравнения групп (табл. 1), где эти показатели статистически значимо различались между группами (p<0,001 для возраста и числа попыток ЭКО, p=0,735 для АМГ) и потенциально могли выступать в роли вмешивающихся факторов, связанных с решением о ПГТ-А и вероятностью живорождения. Полное распределение всех трех ковариат в исследуемой выборке раздельно по группам сравнения приведено в таблице 1; совместное рассмотрение обеих групп в этой таблице отражает распределение ковариат во всей аналитической выборке (n=226).
Автоматизированная процедура отбора предикторов (пошаговая регрессия, в том числе предварительный однофакторный скрининг с последующим включением в модель статистически значимых при однофакторном анализе переменных) намеренно не применялась. Такой подход мог привести к ошибочному включению или исключению коррелированных между собой переменных на основании статистической значимости, не отражающей их истинную клиническую роль как вмешивающихся факторов. Вместо этого использован ограниченный набор заранее клинически обоснованных ковариат, что при достаточном соотношении числа исходов на предиктор (106 живорождений на 4 переменные модели, ≈27 исходов на предиктор – существенно выше общепринятого минимального ориентира ≥10 событий на предиктор) обеспечивает более надежную оценку эффекта, чем процедуры отбора на основании данных. Таким образом, коррекция на потенциальные вмешивающиеся факторы была выполнена для всех трех заранее определенных ковариат; отдельный предварительный этап однофакторного скрининга предикторов не проводился и не планировался.
Модель имела вид: ln[p/(1-p)] = β0 + β1X1 + β2X2 + β3X3 + β4X4, где p –вероятность живорождения после исследуемой пункции ооцитов, X1 – применение ПГТ-А, X2 – возраст пациентки, X3 – число предыдущих попыток ЭКО, X4 – уровень АМГ.
Результаты представлены как коэффициенты β, стандартные ошибки (SE), статистика критерия Вальда, значения p и скорректированные ОШ с 95% ДИ для каждой независимой переменной (табл. 2, часть Б). Коллинеарность оценивали по коэффициенту инфляции дисперсии. Качество модели оценивали по критерию Хосмера–Лемешоу (калибровка) и R² Нэйджелкерка (объясненная дисперсия). Дискриминационную способность модели оценивали по площади под ROC-кривой (AUC) с 95% ДИ; калибровку дополнительно иллюстрировали калибровочным графиком. Классификационные характеристики модели (чувствительность, специфичность, прогностическую ценность положительного и отрицательного результата, точность) рассчитывали с использованием таблиц сопряженности 2×2 для порогового значения предсказанной вероятности, выбранного по максимальному значению индекса Юдена (чувствительность + специфичность − 1).
Результаты
Группы сравнения различались по ряду исходных характеристик. Пациентки группы ПГТ-А были старше, чаще относились к категории возраста ≥35 лет, а также имели большее число предыдущих попыток ЭКО (табл. 1), что указывало на исходную несопоставимость групп и учитывалось при многофакторном анализе.
Группы различались по методу оплодотворения: стандартное ЭКО использовали у 58/122 (47,5%) пациенток группы без ПГТ-А и у 35/104 (33,7%) пациенток группы ПГТ-А, тогда как интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоида (ИКСИ) применяли у 41/122 (33,6%) и 58/104 (55,8%) соответственно.
Ключевое различие между группами проявлялось на этапе перехода от эмбриологического этапа к переносу. В группе ПГТ-А перенос эмбриона из исследуемого цикла выполнялся реже: 69/104 (66,3%) против 120/122 (98,4%) в группе без ПГТ-А. Одновременно в группе ПГТ-А было меньше число переносов и количество перенесенных эмбрионов из первого цикла. Эти показатели рассматривались как промежуточные характеристики реализации программы ВРТ, отражающие эффект эмбриологического и генетического отбора, но не как самостоятельные клинические конечные точки.
Среди морфологических характеристик перенесенных бластоцист значимое различие выявлено по частоте бластоцист с оценкой ≥3BB: данный показатель был выше в группе ПГТ-А – 72/76 (94,7%) против 89/107 (83,2%). По характеристикам внутренней клеточной массы и трофэктодермы статистически значимых различий между группами не выявлено.
При оценке клинических исходов среди выполненных переносов частота клинической беременности была ниже в группе ПГТ-А: 51/85 (60%) против 91/121 (75,2%); ОР 0,80; 95% ДИ 0,65–0,98. Частота беременности сроком ≥12 недель также была численно ниже в группе ПГТ-А: 42/85 (49,4%) против 74/118 (62,7%), однако различие не достигло статистической значимости. Потеря клинической беременности значимо не различалась между группами.
Кумулятивная частота живорождения была ниже в группе ПГТ-А: 38/104 (36,5%) против 68/122 (55,7%); ОР 0,66; 95% ДИ 0,49–0,88. Таким образом, несмотря на отбор эмбрионов и более высокий процент перенесенных бластоцист с морфологической оценкой ≥3BB, применение ПГТ-А в данной выборке не было ассоциировано с улучшением клинических исходов на пункцию ооцитов.
В многофакторную логистическую регрессионную модель были включены 226 наблюдений. Применение ПГТ-А было ассоциировано со снижением шансов живорождения после исследуемой пункции ооцитов: b=-0,693; скорректированное ОШ 0,50; 95% ДИ 0,28–0,89; p=0,020. Возраст пациентки также был связан со снижением шансов живорождения: b=-0,091; скорректированное ОШ 0,91; 95% ДИ 0,84–0,99; p=0,025. Число предыдущих попыток ЭКО и уровень АМГ статистически значимой связи с живорождением не показали. Признаков коллинеарности между включенными переменными не выявлено: максимальный коэффициент инфляции дисперсии составил 1,24. Качество модели было удовлетворительным: критерий Хосмера–Лемешоу χ²=8,56; df=8; p=0,381; R² Нэйджелкерка 0,078. Калибровка модели дополнительно представлена графически на рисунке 3 (калибровочный график). Площадь под ROC-кривой (AUC) составила 0,644 (95% ДИ 0,569–0,712), что указывает на ограниченную дискриминационную способность модели. Полная таблица коэффициентов представлена в таблице 2 (часть Б), ROC-кривая и калибровочный график – на рисунке 3.
В подгруппе 25 пар с повторной остановкой раннего эмбрионального развития у 7/25 (28%) пар идентифицированы редкие генетические варианты в генах, ассоциированных с ранним эмбриогенезом или мужским фактором бесплодия. У 16 пар клинически релевантных вариантов, соответствующих исследуемому эмбриологическому фенотипу, не выявлено.
Среди фенотипически релевантных находок выявлены варианты в генах TBPL2, DNAH7, TLE6, STK33, DNHD1, PADI6, а также дупликация в локусе Xp22.13–p22.12 с вовлечением гена ADGRG2. Часть вариантов представляла собой преждевременные стоп-кодоны или структурные перестройки, однако большинство находок классифицировано как варианты неопределенной клинической значимости, что требует осторожной интерпретации и сопоставления с фенотипом пары.
Все варианты интерпретированы в соответствии с критериями ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics). Детальная характеристика находок представлена в таблице 3.
Вариант TLE6 c.927C>G (NM_001143986.2, p.Ile309Met) зарегистрирован в dbSNP как rs761252299, частота в gnomAD v4.1.0 – 2 аллеля на 1613976 хромосом, гомозигот нет. Предсказания патогенности разнонаправлены (CADD 20,4; PolyPhen-2 0,421; SIFT – патогенный; REVEL – непатогенный). Гомозиготные варианты TLE6 описаны при остановке созревания ооцита и эмбриона (OMIM:616814). Дупликация Xp22.13-p22.12 (chrX:19002846-19569188, GRCh38, ~566 т.п.н.) затрагивает 4 гена по данным DECIPHER, включая экзоны 1-24 ADGRG2, для структурных вариантов rsID не присваивается. Потеря функции ADGRG2 описана при Х-сцепленном отсутствии семявыносящих протоков (OMIM:300985); дупликации такого размера отсутствуют в DGV Gold, gnomAD SV и gnomAD CNV.
Обсуждение
Настоящее исследование было направлено на оценку эмбриологических и клинических исходов фактического применения ПГТ-А при БНГ, поскольку доступные данные для этой категории пациенток остаются ограниченными. В отличие от состояний с установленным генетическим риском, повторными репродуктивными потерями или повторными неудачами имплантации, БНГ является диагнозом исключения и само по себе не является утвержденным формальным показанием к проведению ПГТ-А. В то же время в реальной клинической практике решение о применении ПГТ-А нередко принимается индивидуально у пациенток с неудачными попытками ВРТ, старшим репродуктивным возрастом, неблагоприятным репродуктивным анамнезом или предполагаемым риском отсутствия пригодного для переноса эмбриона. Таким образом, существует разрыв между формальными клиническими показаниями и фактическим использованием ПГТ-А в группе пациенток с БНГ. Именно эта зона клинической неопределенности и стала основанием для настоящего исследования.
Формальными показаниями к ПГТ-А, установленными протоколом лечения, утвержденным письмом Минздрава России, являются: ≥2 самопроизвольных выкидыша, ≥3 неудачных переноса эмбрионов у женщин моложе 35 лет (≥2 у женщин 35 лет и старше), тяжелые формы патозооспермии. Ниже уточняется, в какой мере исследуемая выборка соответствует этим критериям [15].
По данным исследования, ни у одной из включенных пациенток (0/226) не зарегистрировано ≥2 самопроизвольных выкидышей в анамнезе – ожидаемый результат, поскольку привычное невынашивание беременности являлось критерием исключения из исследования. Число предшествующих неудачных переносов эмбрионов (в отличие от общего числа попыток ЭКО) и степень тяжести патозооспермии партнера не входили в число заранее определенных переменных настоящего анализа, в связи с чем оценить долю пациенток, соответствующих этим двум критериям, по имеющимся данным не представляется возможным – это ограничение анализа, а не фактической полноты медицинской документации. Мы указываем это как ограничение исследования и как направление для последующей работы: более детальная регистрация репродуктивного анамнеза в будущих исследованиях позволит раздельно оценить эффект ПГТ-А в подгруппах пациенток, соответствующих и не соответствующих формальным критериям, что имеет практическое значение для персонализации подхода к ведению пациенток с БНГ.
Поэтому интерпретация результатов должна учитывать исходный возраст пациенток, число предшествующих попыток ЭКО и вероятность отмены переноса при отсутствии эуплоидного эмбриона.
В группе пациенток до 39 лет с БНГ, которым проводилось ПГТ-А, доля эуплоидных эмбрионов составляла около половины биопсированных эмбрионов, тогда как после 39 лет она заметно снижалась. Эти данные согласуются с общим представлением о влиянии возраста женщины на хромосомный статус эмбрионов и указывают на то, что БНГ не следует рассматривать как самостоятельный фактор повышенной частоты анеуплоидии эмбрионов [5, 18].
Полученные результаты подчеркивают гетерогенность БНГ. У части пациенток снижение доли эуплоидных эмбрионов имеет возраст-зависимый характер, тогда как у других пар нарушения эмбриогенеза ассоциированы с редкими генетическими вариантами, потенциально влияющими на ранний эмбриогенез. При этом основные количественные показатели овариального ответа и раннего эмбрионального развития в группах сравнения были сопоставимы.
Более низкая кумулятивная частота живорождения в группе ПГТ-А, вероятно, была ассоциирована с более высокой частотой отмены переноса при отсутствии эуплоидных эмбрионов. Данные показывают, что при БНГ клиническая польза ПГТ-А зависит от возраста пациентки, числа бластоцист и вероятности получить эуплоидный эмбрион.
В исследовании Kato K. et al. (2023) были проанализированы данные 7668 пациенток в программах ЭКО с ПГТ-А или без него. Авторы показали, что частота живорождения на один перенос размороженной бластоцисты была выше в группе ПГТ-А во всех возрастных группах, однако прирост общей частоты живорождения за период лечения был выявлен только у пациенток 40–42 лет. Таким образом, эффект ПГТ-А зависел от возраста и выбранной конечной точки [19].
В метаанализе Kasaven L.S. et al. (2023) положительный эффект ПГТ-А был более выражен при анализе исходов на перенос эмбриона, однако авторы подчеркивали неоднородность исследований, различия в группах пациенток и конечных точках [12].
В данной работе частота потери клинической беременности между группами статистически значимо не различалась. С учетом ограниченного размера выборки этот результат следует трактовать осторожно и не использовать как самостоятельное доказательство отсутствия влияния ПГТ-А на риск репродуктивных потерь.
Биопсия трофэктодермы является инвазивным методом, однако современная техника на стадии бластоцисты считается безопасной [19, 20]. Вместе с тем ПГТ-А увеличивает стоимость лечения и может приводить к отмене переноса при отсутствии эуплоидных эмбрионов, поэтому решение о его проведении при БНГ должно быть индивидуальным и учитывать возраст, число бластоцист, предшествующий репродуктивный анамнез и клинические ожидания пары.
Полученные данные не позволяют рассматривать БНГ как самостоятельное показание к ПГТ-А, однако показывают необходимость дальнейших исследований, направленных на выделение подгрупп пациенток с БНГ, у которых применение ПГТ-А может быть клинически оправдано.
Результаты ПЭС, выполненного в подгруппе пар с БНГ и остановкой раннего эмбрионального развития, подтверждают гетерогенность возможных молекулярных механизмов БНГ. Идентифицированные варианты затрагивают гены, вовлеченные в ключевые процессы эмбриогенеза: субкортикальный материнский комплекс (TLE6, PADI6), транскрипцию на ранних этапах развития (TBPL2), а также структуру и функцию динеинов (DNAH7, DNHD1) и киназную сигнализацию в сперматогенезе (STK33). Другие варианты в этих генах ранее были описаны как причины ранней остановки развития эмбрионов или тяжелых форм мужского бесплодия [8, 21–23]. Однако большинство вариантов представляют собой гетерозиготные носительства в генах, ассоциированных с аутосомно-рецессивными нарушениями репродуктивной функции, и классифицированы как имеющие неясное клиническое значение. Требуются дальнейшие полногеномные, сегрегационные и экспериментальные исследования для подтверждения связи выявленных вариантов с нарушениями раннего эмбриогенеза.
Ограничения. Ограничениями исследования являются ретроспективный характер анализа, одноцентровой характер, исходные различия между группами, а также ограниченный и заранее не рассчитанный объем выборки, определявшийся числом доступных наблюдений за период. Пациентки группы планируемого ПГТ-А были старше и имели больше предшествующих попыток ЭКО, что могло влиять на частоту клинической беременности и живорождения независимо от выполнения ПГТ-А.
Кроме того, в выборку по условиям отбора не вошли пациентки с формальными показаниями к ПГТ-А (в частности, с привычным невынашиванием беременности), в связи с чем результаты не следует распространять на эту категорию пациенток.
Отдельным ограничением является неполнота ретроспективных данных в отношении отслеживания судьбы части эмбрионов, полученных из исследуемой пункции ооцитов: часть наблюдений была исключена из анализа именно по этой причине (рис. 1); это отражает ограничение доступной медицинской документации. Аналогичным образом число предшествующих неудачных переносов эмбрионов и степень тяжести патозооспермии партнера – два из трех формальных критериев, установленных протоколом лечения [15] для показаний к ПГТ-А, – не собирались как отдельные переменные в ретроспективной базе данных (табл. 1) и не могут быть представлены количественно; единственный формальный критерий, который можно было оценить по имеющимся данным (привычное невынашивание беременности), являлся критерием исключения из исследования, вследствие чего ни у одной из 226 включенных пациенток (0/226) формальное соответствие исследуемым критериям показаний к ПГТ-А не может быть документально подтверждено по построению выборки. Иными словами, применение ПГТ-А в исследуемой когорте во всех случаях происходило вне рамок формальных клинических показаний, что само по себе ставит вопрос о клинической обоснованности его применения у пациенток с БНГ и должно приниматься во внимание при интерпретации представленных результатов.
Дополнительные ограничения: разное распределение методов оплодотворения (ЭКО/ИКСИ/50-50) между группами (p=0,003, табл. 1), определяемое клиническими показаниями, метод оплодотворения не включен в модель как ковариата. Верификация вариантов в таблице 3 методом секвенирования по Сэнгеру не проводилась, их классификация основана на глубине прочтения NGS, согласованности алгоритмов SIFT/PolyPhen-2/SpliceAI и базах OMIM/ClinVar/LOVD/gnomAD.
Сильной стороной работы является анализ полного клинического пути от пункции ооцитов до живорождения. Такой подход особенно важен при БНГ, поскольку оценка только исходов на перенос может переоценивать пользу ПГТ-А и не учитывать клинически значимую частоту отмены переноса.
Заключение
Таким образом, в данной ретроспективной выборке применение ПГТ-А при БНГ не было ассоциировано с повышением кумулятивной частоты живорождения на пункцию ооцитов, что было связано преимущественно с высокой частотой отмены переноса при отсутствии эуплоидного эмбриона. У пациенток старше 39 лет тестирование может быть информативным для оценки эмбриологического прогноза, однако решение должно приниматься индивидуально с учетом числа бластоцист, возраста и репродуктивного анамнеза. ПЭС выявило редкие генетические варианты у 7/25 (28%) пар с повторной остановкой развития эмбрионов, большинство – VUS в гетерозиготном состоянии, что не позволяет установить их патогенность без второго варианта в гене. Находки подчеркивают генетическую гетерогенность БНГ и обосновывают дальнейший молекулярно-генетический поиск при нарушениях эмбриогенеза.
