История открытия ботулотоксина и его внедрения в практику

Первое детальное описание клинической картины ботулизма – смертельного пищевого отравления – принадлежит доктору Justinus Kerner из Вюртемберга. На основании наблюдений 1817–22 гг. он описал симптомы ботулизма: недомогание, рвоту, диарею, диплопию, мидриаз, неустойчивую походку, затрудненное глотание, а в терминальных стадиях – нисходящий паралич, бессознательное состояние, сильные судороги, озноб, опистотонус, холодный пот и смертельный исход. J. Kerner также предположил, что чрезвычайно малые дозы “колбасного яда” могут быть полезны в лечении гиперкинезов, таких как пляска святого Витта.

В 1897 г. бельгийский профессор Emile van Ermengen доказал бактериальную природу ботулизма. Выделенные им микробы – анаэробные спорообразующие бациллы – были названы Bacillus botulinum (от лат. botulus – колбаса). Позже их назвали Clostridium botulinum. В это же время W. Kerner создал первую иммунную сыворотку для лечения ботулизма.

Исследователь Alan B. Scott, изучавший лекарственные средства, способные ослабить активность гиперкинетических мышц, первым испытал ботулотоксин на животных (1973), а затем возглавил небольшое исследование на людях (1978). Предварительные данные А. Scott по использованию ботулотоксина А в лечении косоглазия были опубликованы в 1980 г. [8]. Эти результаты стимулировали целую серию исследований по использованию ботулотоксина А по другим показаниям. В 1982 г. А. Scott исследовал влияние ботулотоксина на нистагм, лицевой гемиспазм, спастическую кривошею и спастические заболевания ног.

Ботулотоксин А был одобрен FDA для лечения косоглазия, лицевого гемиспазма и блефароспазма в декабре 1989 г. В настоящее время ботулотоксин А широко применяют по многочисленным показаниям, выходящим за рамки разрешенных официально. Резко возросшее число публикаций на эту тему отражает огромный интерес к ботулотоксину и его терапевтическую значимость.

Использование ботулотоксина А (Диспорт) в неврологии

Ранние сообщения об успешных результатах использования ботулотоксина у людей открыли перед неврологами возможность исследования других потенциально возможных показаний к применению ботулотоксина – неврологических заболеваний, которые до этого плохо поддавались лечению или их лечение было фактически невозможным из-за тяжелых побочных эффектов. Таким первым утвержденным неврологическим показанием стала дистония. В настоящее время ботулотоксин А (Диспорт) применяется для лечения ряда других неврологических заболеваний: блефароспазма, спастической кривошеи, дисфонии, тиков, нистагма, лицевого гемиспазма, спастичности, используется для уменьшения тремора.

История применения ботулотоксина А в косметологии

В 1990 г. в журналах “Дерматология” и “Хирургическая онкология” были опубликованы первые статьи об использовании ботулотоксина типа А в косметологической дерматологии.

Открытие косметических эффектов ботулотоксина А, как и многие другие медицинские открытия, было случайным. Одна из больных, которая регулярно лечилась по поводу блефароспазма, обратила внимание на то, что ее морщины, особенно в надпереносье, после курса терапии ботулотоксином стали менее выраженными. В своем докладе в 1993 г. Andrew Blitzer описал использование ботулотоксина А в лечении гиперфункциональных морщин в области лба и подкожной мышцы шеи.

Отчетливое уменьшение морщин, наблюдаемое после единственной инъекции, быстро привело к широкому распространению этой техники лечения. Примерно с 1995 г. начался экспоненциальный рост применения ботулотоксина в лечении гиперфункциональных лицевых складок экспрессии. Сегодня ботулотоксин применяют по самым разным показаниям, в т. ч. и для лечения ладонного, подошвенного и аксиллярного гипергидроза.

В настоящее время возможности использования ботулотоксина А (Диспорт) изучаются прежде всего дерматологами, оториноларингологами, офтальмологами и пластическими хирургами.

Фармакология и токсикология

Структура и серотипы ботулотоксина

Ботулотоксин является экзотоксином, продуцируемым спорообразующими анаэробными бактериями Clostridium botulinum. Ботулотоксин – это полипептид, состоящий из легкой

(50 кДа) и тяжелой (100 кДа) цепей, соединенных дисульфидными мостиками и атомом цинка. Такая структура очень лабильна и легко меняет конфигурацию под действием физических и химических факторов. Поэтому в лекарственной форме структуру токсина стабилизируют путем создания комплекса с гемагглютинином. Дополнительная стабилизация обеспечивается присутствием альбуминов. Большая молекулярная масса комплекса способствует стабилизации структуры ботулотоксина и сохранению его биологической активности; кроме того, уменьшается диффузия препарата в окружающие ткани и обеспечивается локальность его действия. В то же время присутствие дополнительных белков провоцирует формирование нейтрализующих антител ко всему комплексу ботулотоксин-гемагглютинин, что может приводить ко вторичной резистентности.

В настоящее время известно 7 серотипов ботулотоксина (A, B, C, D, E, F, G), схожих по первичной и третичной структуре и по функции. Кроме того, ботулотоксин по структуре гомологичен столбнячному токсину. Все серотипы ботулотоксина связываются с одним и тем же рецептором, но поражают разные белки в пределах одного синапса. Разные серотипы имеют разную эффективность и продолжительность действия. Ботулотоксин А является самым мощным, и его действие продолжается дольше, чем у других серотипов. Именно серотип А шире всего применяют в терапевтических целях, хотя серотипы В, С и F также используют в клинике и/или в экспериментах. Серотип А приблизительно в 10 раз токсичнее, чем серотип С, и примерно в 20 раз токсичнее серотипа В. При использовании для лечения людей эффект ботулотоксина серотипа В длится около 6 недель, а серотипа А – приблизительно 4–5 недель.

Механизм действия

Общий механизм действия всех ботулотоксинов заключается в пресинаптической блокаде выброса ацетилхолина в нервно-мышечных окончаниях двигательных нервов и в любых других холинергические синапсах.

Передача нервного импульса в холинергическом синапсе происходит в несколько этапов. В пресинаптической терминали постоянно синтезируется и накапливается ацетилхолин в виде пузырьков, которые в дальнейшем транспортируются к пресинаптической мембране с тем, чтобы медиатор мог выйти в синаптическую щель и связаться со специфическими холинергическими рецепторами постсинаптической мембраны. После этого на постсинаптической мембране возникает потенциал и происходит сокращение мышечного волокна. Однако транспорт пузырьков к пресинаптической мембране происходит не спонтанно, а активно, с помощью комплекса особых транспортных белков, главными из которых являются SNAP-25, синтаксин и синаптобревин. Именно транспортные белки являются мишенью ботулотоксинов.

При попадании ботулотоксин-содержащих комплексов в мышцу молекулы комплекса достигают терминалей аксонов и прикрепляются к ним. Затем нейротоксиновая часть комплекса внедряется в плазматическую мембрану нервного окончания.

Действие токсина складывается из 3 этапов: интернализации, разрушения дисульфидной связи и разделения цепей молекулы и, наконец, проявления ферментативной активности легкой цепи.

Интернализация. Тяжелая цепь обеспечивает быстрое и специфическое связывание ботулотоксина со специфическими рецепторами на плазматической мембране холинергических аксонов. Затем токсин путем эндоцитоза проникает в лизосомальные пузырьки в пресинаптических терминалях. Этот процесс зависит от запаса энергии и в определенной степени от уровня синаптической активности.

Разрушение дисульфидных связей и разделение цепей. Механизм разрыва дисульфидных связей пока неизвестен. N-концевая часть тяжелой цепи способствует проникновению легкой цепи через мембрану эндосомы в цитоплазму.

Проявление ферментативной активности легкой цепи. Эта цепь действует как цинк-зависимая эндопептидаза. Разные серотипы ботулотоксина расщепляют разные транспортные белки, ответственные за экзоцитоз синаптических пузырьков. Серотипы А и Е расщепляют SNAP-25 (синаптосомный белок с мол. массой 25000), серотипы В, D, F, G – синаптобревин-2, а серотип С – синтаксин и SNAP-25.

После разрушения транспортных белков синапс блокируется и, следовательно, ацетилхолин не выделяется в синаптическую щель. Конечным эффектом этой химической денервации являются слабость и атрофия поперечнополосатых мышц, атония гладких мышц, снижение или прекращение потоотделения.

Расщепление транспортных белков ботулотоксином А (Диспорт) необратимо и длится 30–60 минут. В то же время клиническое миорелаксирующее действие препарата начинает проявляться только через несколько дней. Показано, что более стойкие и полные эффекты токсина проявляются при максимальном мышечном сокращении, при достаточной внутриклеточной концентрации K⁺, при воздействии низких температур. Размер области денервации зависит от дозы и объема введенного токсина. Наилучшие результаты достигаются при равномерном распределении препарата Диспорт в несколько точек вдоль одной мышцы.

При локальном введении в терапевтических дозах ботулотоксин не проникает через гематоэнцефалический барьер и не вызывает существенных системных эффектов. После инъекции препарата Диспорт случаев некроза, атрофии мышц или воспаления не отмечалось.

Через 1–2 месяца после введения Диспорта от аксонов начинают отрастать новые терминали с образованием новых функционально-активных нервно-мышечных синапсов (так называемый sprouting – спрутинг), что через 3–6 месяцев приводит к восстановлению мышечных сокращений. В некоторых случаях эффект препарата Диспорт может длиться дольше (например, 9–12 месяцев при лечении гипергидроза).

Резистентность к ботулотоксину

Первичная резистентность к ботулотоксину встречается крайне редко (менее 0,1 %). Вероятной ее причиной являются антитела, появившиеся после перенесенного ботулизма либо вакцинации и пр. Распознать первичную резистентность после первой процедуры терапии ботулотоксином трудно, так как кратковременное (2–3 недели) или полное отсутствие эффекта может быть вызвано инактивацией токсина из-за неправильной транспортировки или хранения. Только в том случае, если повторная инъекция (через 2 месяца после первой) в той же дозе и в те же точки не окажет эффекта, можно с большой вероятностью говорить о первичной резистентности у данного пациента.

В литературе есть данные о том, что примерно 3–5 % больных цервикальной дистонией стали резистентными к ботулотоксину А после одной или более инъекций. Причиной вторичной резистентности явилось образование нейтрализующих антител (IgG). К главным факторам риска образования антител относят введение высоких доз ботулотоксина или введение малых доз через короткие промежутки времени. Резистентности можно избежать, для этого необходимо:

• использовать наименьшие эффективные дозы ботулотоксина А;
• увеличить интервал между инъекциями до 3 месяцев.

В случае образования антител к ботулотоксину А возможен переход на другие серотипы, например серотип В (препарат Нейроблок). Однако клинический эффект других серотипов продолжается меньше, а необходимые дозы выше, чем у ботулотоксина А.

Препараты и их активность

В настоящее время ботулотоксин А – наиболее важный серотип, имеющийся в продаже. В Европе доступны

2 препарата ботулотоксина А – Диспорт (Dysport^®; Ipsen Biopharm Ltd. Великобритания) и Ботокс (Botox^®; Allergan, Irvine, CA, США), а также препарат ботулотоксина B – Нейроблок (Neurobloc^®; Elan Pharmaceuticals). Дозировки препаратов основываются на их биологической активности и выражаются либо в единицах (ЕД), либо в мышиных единицах (1 ЕД = 1 MЕД). Одна единица соответствует LD₅₀ препарата, который вводится мышам-самкам Swiss-Webster с массой тела 18–22 г. Эффективность препаратов существенно различается. Одна единица Ботокса соответствует примерно 3 единицам Диспорта. В настоящее время в России успешно применяется препарат Диспорт на основе ботулотоксина А. Препарат прекрасно зарекомендовал себя в неврологии и эстетической медицине.

Показания к применению препарата Диспорт

Показаниями к применению препарата являются:

• гиперактивность поперечнополосатых мышц (блефароспазм, спастическая кривошея, спастичность, ригидность, тики, нейрогенные и миогенные спазмы мышц, динамическая деформация стопы у детей с церебральным параличом, косоглазие, нистагм, гиперактивность мимических мышц лица);
• гиперактивность гладких мышц (ахалазия кардии, нарушение мочеиспускания, спастический запор, геморрой, трещины прямой кишки);
• локальный гипергидроз (аксиллярный, ладонный, подошвенный);
• болевые синдромы (головные боли напряжения, мигрень, лицевая боль, миофасциальная боль).

Выбор препарата Диспорт определяется практическим опытом врача и индивидуальными особенностями пациента.

Сравнительное изучение переносимости, эффективности, длительности действия и побочных реакций не выявило значимых различий между двумя препаратами ботулотоксина А.

В то же время имеется немало публикаций, доказывающих большую стабильность Диспорта, что делает его более удобным при транспортировке и хранении. Поскольку суммарная активность Диспорта в 1 флаконе (500 ЕД) выше, чем суммарная активность Ботокса (100 ЕД), процедура эстетической коррекции с помощью Диспорта экономически более выгодна для пациента. Более активная диффузия Диспорта в тканях является значительным преимуществом при лечении локального гипергидроза, но повышает риск птоза при коррекции горизонтальных мимических морщин лба. Однако на сегодняшний день можно утверждать, что эффективность и безопасность процедуры зависит в первую очередь от техники врача, оптимального подбора дозы для конкретной зоны у конкретного пациента, учета анамнеза и индивидуальной чувствительности пациента к ботулотоксину, а не от вида препарата.

Лекарственные взаимодействия

Не рекомендуется введение ботулотоксина на фоне применения следующих групп препаратов:

• влияющих на нервно-мышечную передачу: антибиотиков группы аминогликозидов (гентамицин, канамицин, эритромицин, стрептомицин), тетрациклина, линкомицина, полимиксинов, которые усиливают миорелаксирующее действие токсина;
• миорелаксантов (рокурония бромид, суксаметония хлорид и др.);
• антагонистов кальция (верапамил, амлодипин);
• транквилизаторов (диазепам), анестетиков.

Противопоказания

Абсолютные: заболевания с нарушением холинергической передачи (Myasthenia gravis, синдром Итона–Ламберта), повышенная чувствительность к компонентам препарата.

Относительные: хронические заболевания в стадии обострения, воспалительный и/или инфекционный процесс в зонах предполагаемых инъекций, гемофилия, прием антикоагулянтов и антиагрегантов, злоупотребление алкоголем.

Безопасность и эффективность лечения детей ботулотоксином А на сегодняшний день не изучена. Опыт применения ботулотоксина при беременности и лактации также ограничен.

Врачи, применяющие этот метод лечения, должны иметь достаточный уровень знаний относительно нервно-мышечных связей, анатомии лицевых мышц и техники стандартной электромиографии, а также быть специально обученными методике терапевтического использования Диспорта.

Побочные эффекты

Некоторые клинически значимые побочные эффекты связаны непосредственно с техникой введения препарата. Например, при внутрикожных или подкожных инъекциях ботулотоксина могут наблюдаться временная локальная болезненность и кровоизлияния. Фармакологически объяснимые побочные эффекты включают чрезмерную слабость мышц-мишеней и парез соседних мышц. Например, при коррекции мимических морщин лба и наружного угла глаза, а также после лечения блефароспазма может наблюдаться птоз, возникающий из-за ненамеренной слабости мышцы, поднимающей веко, и диплопия, появляющаяся из-за распространения действия токсина на экстраокулярные мышцы. При лечении спастической кривошеи после инъекций препарата в грудино-ключично-сосцевидную мышцу токсин проникает в мышцы глотки, приводя тем самым к дисфагии. При лечении писчего спазма инъекции ботулотоксина могут вызвать парез, нарушающий функцию одного пальца или некоторые движения руки. Побочные эффекты изменчивы и зависят от места введения токсина, а их выраженность и частота зависят от дозы.

Об анафилактическом шоке, вызванном ботулотоксином А, не сообщалось. Нет и данных о системном токсическом действии при введении Диспорта по неврологическим показаниям и в косметологических целях.

Точных данных о токсичности ботулотоксина для человека нет. Если основываться на опытах на обезьянах, то при внутримышечных инъекциях токсина приблизительная расчетная LD₅₀ для человека весом 70 кг составляет 10000 ЕД Диспорта.

В 2–5 % случаев наблюдаются местные реакции: боль в месте инъекции (до суток), микрогематомы (до 7 дней). Наиболее частыми осложнениями при применении ботулотоксина в косметологии являются птоз, диплопия, опущение бровей, отечность и припухлость периорбитальной области, гипо- и гиперкоррекция, асимметрия эффекта, головная боль, нарушение артикуляции (см. таблицу).

Все побочные эффекты ботулотоксина полностью обратимы, не требуют лечения и проходят в течение месяца после инъекции.

Условия хранения и использования ботулотоксина А

Препарат Диспорт поставляется в лиофилизированном виде. Диспорт надо хранить при температуре от 2 до 8 °С. Лиофилизированный препарат разводят физиологическим раствором непосредственно перед использованием. Объем растворителя зависит от показаний и желаемой конечной концентрации препарата. Компания-производитель рекомендует разводить Диспорт 500 ЕД в 2,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида (NaCl).

Диспорт должен быть использован в течение 8 часов после растворения. Раствор ботулотоксина хранят в холодильнике, не замораживая, так как при оттаивании могут нарушиться структура и активность ботулотоксина, из-за чего нельзя будет правильно его дозировать при повторном использовании.