Инциденталомы надпочечников: диагностика гормональных нарушений методом газовой хромато-масс-спектрометрии


DOI: https://dx.doi.org/10.18565/pharmateca.2020.12.56-63

Л.И. Великанова, З.Р. Шафигуллина, Н.В. Ворохобина, Е.В. Малеваная, Ж.В. Пальцман, А.В. Кузнецова

Северо-Западный медицинский университет им И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
Обоснование. При пограничных значениях гормональных показателей в сомнительных ситуациях для выбора оптимальной тактики лечения пациентов с инциденталомой надпочечников (ИН) возникает необходимость изучения стероидного метаболома с использованием методов хроматографии, среди которых газовая хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС) стероидов мочи наиболее информативна.
Цель исследования: изучить особенности метаболизма стероидов у больных ИН с использованием метаболомного анализа на основе газовой хромато-масс-спектрометрии.
Методы. Стероидные профили мочи исследовали методом ГХ-МС на газовом хромато-масс-спектрометре SHIMADZU GCMS-
QP2020 с использованием жидкостной экстракции. Функциональное состояние системы гипофиз–кора надпочечников оценивали иммунохемилюминесцентным методом.
Результаты. Обследованы 205 больных ИН. У 29 из них с автономной секрецией кортизола (АСК) с его уровнем после пробы с 1 мг дексаметазона более 140 нмоль/л и у 35 пациентов с возможной АСК (ВАСК) с уровнем кортизола после пробы с 1 мг дексаметазона менее 140 нмоль/л. Получены общие хроматографические признаки снижения андрогенной и повышения глюкокортикоидной функций коры надпочечников, которые была выше у пациентов с АСК. Среди 141 пациента с нормальными результатами теста с 1 мг дексаметазона у 15 (10,6%) больных обнаружены хроматографические признаки дефицита фермента 21-гидроксилазы, у 83 (58,9%) – повышение андрогенной и минералокортикоидной функций надпочечников, положительная корреляция андрогенов и их метаболитов с наличием злокачественного потенциала, что необходимо учитывать при решении вопроса об оперативном лечении.
Заключение. Признаки снижения активности 11β-гидроксистероиддегидрогеназы 2-го типа и 11β-гидроксилазы были общими нарушениями метаболизма стероидов у пациентов с АСК и ВАСК. От пациентов с АСК получено повышение активности 5β-редуктазы, экскреция с мочой тетрагидрометаболитов кортизола, кортизона, кортикостерона и 11-дезоксикортизола была выше по сравнению с показателями пациентов с ВАСК. От пациентов с ИН с уровнем кортизола после пробы с 1 мг дексаметазона менее 50 нмоль/л получены признаки недостаточности 21-гидроксилазы (10,6%), увеличение андрогенной и минералокортикоидной функций коры надпочечников, недостаточности 11β-гидроксилазы и 17-гидроксилазы у 58,9%.
Ключевые слова: газовая хромато-масс-спектрометрия, стероидный профиль мочи, автономная секреция кортизола, недостаточность 21-гидроксилазы, 11β-гидроксилазы, 17-гидроксилазы, 11β-гидроксистероиддегидрогеназы 2-го типа

Введение

В связи с широким использованием в клинической практике визуализирующих методов обследования случайно выявленные опухоли надпочечников (инциденталомы надпочечников – ИН) стали одной из актуальных проблем эндокринологии и эндокринной хирургии за последние десятилетия. По данным литературы, частота выявления новообразований при проведении компьютерной томографии (КТ) органов брюшной полости больных старше 70 лет достигает 10% [1]. Несмотря на то что у многих пациентов нет специфических клинических проявлений гиперпродукции гормонов, часть из ИН (5–48%) имеет нарушения стероидогенеза. Для определения гормональной активности опухолей надпочечников традиционно используются методы иммунохимического анализа с определением уровней адренокортикотропного гормона (АКТГ) в плазме крови, кортизола в сыворотке крови, экскреции свободного кортизола с мочой, свободного кортизола в слюне, а также различные стимулирующие и подавляющие тесты [2–4]. Специфичность и чувствительность перечисленных лабораторных анализов и тестов составляют 85–90% [5–6]. При пограничных значениях гормональных показателей в сомнительных ситуациях, когда у пациента отмечена коморбидная патология, потенциально связанная с имеющимися новообразованиями надпочечников, для выбора оптимальной тактики лечения больного возникает необходимость в дополнительных высокочувствительных тестах с использованием методов хроматографии, на сегодняшний день наиболее информативных для изучения метаболизма стероидов [2, 7–9]. Большое значение методам хроматографии отведено при диагностике мягких форм гиперкортизолизма, неклассических форм врожденной дисфункции коры надпочечников и других заболеваний с нарушениями стероидогенеза, когда традиционные тесты не всегда информативны [10–11]. Исследование стероидных профилей мочи (СПМ) методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) расширяет возможности лабораторной диагностики за счет определения метаболитов промежуточных продуктов адреналового стероидогенеза [12–14]. Ранее нами были проведены исследования по оценке значения стероидного профилирования методом ГХ-МС для дифференциальной диагностики разных форм гиперкортицизма, заболеваний с синдромом гиперандрогении у женщин, ранней диагностики адренокортикального рака [14–16]. В данной работе мы впервые изучили особенности метаболизма стероидных гормонов у пациентов с ИН в зависимости от степени их функциональной автономии.

Цель исследования: изучить особенности метаболизма стероидов у больных ИН с использованием метаболомного анализа на основе ГХ-МС.

Методы

Обследованы 205 больных опухолями надпочечников без выраженных клинических проявлений и без признаков злокачественного процесса по результатам КТ. У всех больных была нормальная или избыточная масса тела, средний возраст составил 53 (35–65) года. В группу контроля (ГК) вошли 27 здоровых лиц, соответствовавших обследованным по индексу массы тела и возрасту. Все больные ИН были разделены на три большие группы по результатам проведения подавляющего дексаметазонового теста (ПДТ) с 1 мг дексаметазона. У 35 пациентов с уровнем кортизола после пробы от 50 до 138 нмоль/л диагностирована возможная автономная секреция кортизола (ВАСК) опухолью. У 29 пациентов с уровнем кортизола в сыворотке крови более 138 нмоль/л после ПДТ с 1 мг дексаметазона определена автономная секреция кортизола (АСК).

У 141 пациента с ИН уровень кортизола после ПДТ с 1 мг дексаметазона был менее 50 нмоль/л. Топическая диагностика, определение размеров и лучевая характеристика опухолей проведены по результатам КТ надпочечников. Для оценки функционального состояния системы гипофиз–кора надпочечников использовали классические тесты, основанные на методе иммунохемилюминесцентного анализа (ИХЛА) с определением свободного кортизола в слюне, уровней АКТГ в плазме крови, 17-ОН-прогестерона, дегидроэпиандростерон-сульфата (ДЭА-С), кортизола в 9.00 (Ку) и 20.00 (Кв) в сыворотке крови и уровней кортизола после ПДТ с 1 мг дексаметазона. Методом ГХ-МС с оптимизацией регламента пробоподготовки исследовали СПМ [15]. Всего идентифицировано 69 стероидов. СПМ получены на газовом хромато-масс-спектрометре SHIMADZU GCMS-QP2020.

Статистическая обработка полученных результатов осуществлена с применением пакета программ для статистического анализа Statistiсa for Windows (версия 10) и GraphPadPrism 6. При сравнении показателей использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Проводили корреляционный анализ с применением коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Основные количественные характеристики больных представлены в виде медианы (Me), 25-го и 75-го перцентилей (Q25–Q75). Статистически значимым считался критерий достоверности р<0,05. Исследование проведено в соответствии с Международными стандартами надлежащей клинической практики GCP (Good Clinical Practice).

Результаты

У пациентов с ВАСК уровень кортизола в сыворотке крови после ПДТ с 1 мг дексаметазона составил 49,6 (79–139), у пациентов с АСК – 181 (154–315) нмоль/л. В обеих группах пациентов получены общие нарушения метаболизма андрогенов по данным ГХ-МС: снижение экскреции с мочой (ЭМ) метаболитов андростендиона (андростерона – An, этиохоланолона – Et], дегидроэпиандростерона (DHEA) и его метаболитов по сравнению с ГК. Однако ЭМ 11-ОН-An, 11-OH-Et и 11-oxo-Et была увеличена у пациентов с АСК по сравнению с показателями ГК, а ЭМ DHEA (р=0,04), 11-OH-Et (р=0,04) и 11-oxo-Et (р=0,007) была выше у пациентов с ВАСК по сравнению с показателями больных АСК (табл. 1).

58-1.jpg (202 KB)

Пациентами с ВАСК и АСК по сравнению с ГК получено повышение ЭМ метаболитов глюкокортикоидов: 5α-тетрагидрокортикостерона (5α-ТНВ) и тетрагидро-11-дезокси-кортизола (ТНS). Больными АСК дополнительно получено увеличение ЭМ 5β-ТНВ, тетрагидрокортизона (ТНЕ), 5β-тетрагидрокортизола (5β-THF), 5α-THF, α- и β-кортолонов, суммы α-кортола и β-кортола по сравнению с показателями пациентов как с ГК, так и с показателями пациентов с ВАСК (табл. 1).

Общим нарушением метаболизма глюкокортикоидов у пациентов обеих групп было снижение активности фермента 11β-HSD 2-го типа, участвовавшего в превращении биологически активного кортизола в менее активный кортизон и кортикостерона – в 11-дегидрокортикостерон (А), о чем свидетельствует увеличение соотношений 5β-THF/ТНЕ, (5β-THF+5α-THF)/ТНЕ и ТНВ/ТНА. Уменьшение активности фермента 11β-гидроксилазы, что подтверждается снижением соотношения (5β-THF+5α-THF+ТНЕ)/THS, способствует накоплению малоактивного 11-дезоксикортизола и 11-дезоксикортикостерона, обладающего минералокортикоидной активностью, при замедлении образования кортизола и кортикостерона. От пациентов с АСК были получены признаки повышения активности 5β-редуктазы: снижение соотношений An/Et и 5α-THF/5β-THF (табл. 2).

59-1.jpg (69 KB)

Уровень кортизола после ПДТ с 1 мг с дексаметазоном меньше 50 нмоль/л получен у 141 пациента с ИН. От 43 пациентов с ИН с уровнем кортизола после ПДТ с 1 мг дексаметазона менее 50 нмоль/л не было получено данных о нарушениях метаболизма кортикостероидных гормонов. ЭМ андрогенов, тетрагидрометаболитов глюкокортикоидов (THF, THE, THB, THS) и тетрагидро-11-дезоксикортикостерона (THDOC) не отличалась от показателей ГК (p>0,05). Данные пациенты вошли в группу гормонально-неактивных аденом надпочечника (ГНА). У 15 больных ИН и уровнем кортизола после ПДТ с 1 мг менее 50 нмоль/л получены СПМ по данным ГХ-МС, характерные для недостаточности фермента 21-гидроксилазы (21-ГН). У данных пациентов была увеличена ЭМ андрогенов: DHEA и его метаболитов, 5α-метаболитов андростендиона (An, 11-OH-An), метаболитов 17-ОН-прогестерона (17-OH-прегнанолона – 17P, прегнантриола – P3, 11-oxo-P3) и метаболитов прегненолона (прегнендиола – dP2, 16-OH-dP2, прегнентриола – dP3) по сравнению с ГК (табл. 3).

59-2.jpg (162 KB)

У пациентов с 21-ГН было получено снижение соотношений (5β-THF+5α-THF+ТНЕ)/Р3 (меньше 2,2), (5β-THF+5α-THF+ТНЕ)/11-охо-Р3 (меньше 16,0) и (5β-THF+5α-THF+ТНЕ)//17Р (меньше 13,0), которые являются основными биомаркерами 21-ГН, по данным ГХ-МС [16]. Увеличение соотношений 11-ОН-Аn/11-OH-Et, 5α-THB/5β-THB и 5α-THF/5β-THF свидетельствовало о повышении активности 5α-редуктазы у пациентов с 21-ГН (табл. 4).

Кроме этого у пациентов с 21-ГН были определены стероиды, не детектируемые у здоровых лиц и характерные для дефекта 21-ГН: 21-deoxy-THF, 16-гидроксилированные метаболиты прегнанолона, 5-еne-прегнены (табл. 5).

61-1.jpg (83 KB)

У 83 больных ИН и с уровнем кортизола после ПДТ с 1 мг менее 50 нмоль/л была повышена ЭМ метаболитов глюкокортикоидов (ТНЕ, 5α-ТНF, 5β-ТНF, ТНS, α- и β-кортолонов), увеличена минералокортикоидная функция коры надпочечников, связанная с повышением ЭМ тетрагидрометаболитов – предшественников альдостерона (5β-THB, 5α-THB, ТНА и THDOC), по сравнению как с ГК (р<0,01), так и с ГНА (рис. 1). ЭМ андрогенов у данных пациентов с ИН с различными НМС была повышена по сравнению с показателями пациентов с ГНА, но не отличалась от ГК (р>0,05, рис. 2). От пациентов с ИН с НМС получены признаки снижения активности 11β-гидроксилазы: увеличение ЭМ ТНS и THDOC, снижение соотношения (5β-THF+5α-THF+THF)/ТНS до 41,3 (24,7–55,0) по сравнению с ГК (р<0,0001) и ГНА (р<0,0001), определение ЭМ гексагидро-11-дезоксикортизола – 110 (38–159) мкг/24 ч. У пациентов с ИН и НМС увеличение ЭМ 5β-ТНВ, 5α-ТНВ и ТНА, снижение соотношения (5β-THF+5α-THF+ТНЕ)/(5β-ТНВ+5α-ТНВ+ТНА) до 7,2 (5,2–9,9), р=0,015 (меньше 10) и соотношения (An+Et)/(5β-ТНВ+5α-ТНВ+ТНА) до 1,9 (0,8–3,9), p<0,0001 (меньше 4,0) по сравнению с ГК: 11,2 (9,7–17,9) и 6,4 (4,1–10,6) соответственно указывают на уменьшение активности 17-гидроксилазы, что способствует повышению минералокортикоидной функции коры надпочечников. У 17 пациентов с ИН и НМС на основании гистологического анализа послеоперационного материала определен злокачественный потенциал 1–3 балла по шкале L.M. Weiss. Кроме этого от пациентов с ИН с НМС получены положительные корреляции Et (r=0,57), DHEA (r=0,53), 16-OH-DHEA-3β (r=0,58), dA2-17β (r=060) и dA3 (0,77) с наличием злокачественного потенциала, а также определены стероиды, не детектируемые у здоровых лиц и пациентов с ГНА (табл. 5).

60-1.jpg (70 KB)

60-2.jpg (54 KB)

Обсуждение

Исследование СПМ методом ГХ-МС у пациентов с ИН расширяет возможности лабораторной диагностики гормональных нарушений за счет одновременного определения метаболитов андрогенов, глюкокортикоидов, минералокортикоидов и промежуточных продуктов адреналового стероидогенеза [15]. В нашем исследовании получены общие нарушения метаболомики андрогенов и глюкокортикоидов у больных АСК и ВАСК, связанные со снижением экскреции с мочой андрогенов, признаками уменьшения активности 11β-HSD 2 типа и 11β-гидроксилазы.

У пациентов с АСК дополнительно получены признаки повышения активности 5β-редуктазы, у 10,6% пациентов с ИН с уровнем кортизола после ПДТ с 1 мг меньше 50 нмоль/л получены признаки недостаточности 21-гидроксилазы, у 58,9% – нарушения метаболизма андрогенов, глюкокортикоидов и минералoкортикоидов, признаки недостаточности 11β-гидроксилазы и 17-гидроксилазы. Только у 30,5% пациентов с ИН не были отмечены нарушения метаболизма стероидов.

У оперированных больных установлена взаимосвязь повышения экскреции с мочой андрогенов со злокачественным потенциалом опухоли. Полученные данные по метаболомике стероидов методом ГХ-МС играют дополнительную, а в некоторых случаях определяющую роль в решении вопроса о необходимости хирургического лечения.

Заключение

Методом ГХ-МС у больных АСК и ВАСК установлено снижение экскреции с мочой метаболитов андростендиона и дегидроэпиандростерона, признаки уменьшения активности 11β-HSD 2 типа и 11β-гидроксилазы, Увеличение экскреции с мочой тетрагидрометаболитов кортизола, кортизона, кортикостерона и 11-дезоксикортизола, кортолов и кортолонов у пациентов с АСК по сравнению с показателями больных ВАСК свидетельствует о большем повышении глюкокортикоидной функции коры надпочечников в данной группе. У пациентов с ИН с уровнем кортизола после ПДТ с 1 мг меньше 50 нмоль/л установлены различные нарушения метаболомики стероидов по данным ГХ-МС: у 10,6% – признаки недостаточности 21-гидроксилазы, у 58,9% – признаки недостаточности 11β-гидроксилазы и 17α-гидроксилазы, увеличение экскреции с мочой андрогенов, глюкокортикоидов и тетрагидрометаболитов предшественников альдостерона (ТНВ, THA, ТНDOC), Признаки повышения активности 5α-редуктазы получены у больных с 21-ГН, увеличения активности 5β-редуктазы – у пациентов с АСК. У оперированных больных с ИН установлены положитедьные корреляции экскреции с мочой этиохоланолона, DHEA и его метаболитов со злокачественным потенциалом опухоли, определены 5-еne-прегнены, не обнаруженные у пациентов с ГНА. Полученные результаты при исследовании СПМ методом ГХ-МС играют важную роль в определении тактики и объема хирургического лечения пациентов с ИН.


Литература


1. Iniguez-Ariza N.M., Kohlenderg J.D., Delivanis D.A.,et al. Clinical, biochemical, and Radiological Characteristics of a Single-Center Retrospective Cohort of 705 Large Adrenal Tumors. Mayo Clin Proc Innov Qual Outcomes. 2017;2(1):30–9. Doi: 10.1016/j.mayocpiqo.2017.11.002.


2. Fassnacht M., Arlt W., Bancos I., et al. Management of adrenal incidentalomas: European Society of Endocrinology Clinical Practice Guideline in collaboration with the European Network for the Study of Adrenal Tumors. Eur J Endocrinol. 2016;175(2):1–34. Doi: 10.1530/EJE-16-0467.


3. Araujo-Castro M., Nunez M.A.S., Marazuela M.Autonomous cortisol secretion in adrenal incidentalomas. Endocrine. 2019;64:1–13. Doi: 10.1007/s12020-019-01888-y.


4. Бельцевич Д.Г, Кузнецов Н.С., Ванушко В.Э. и др. Клинические рекомендации Российской ассоциации эндокринологов по дифференциальной диагностике инциденталом надпочечников. Эндокринная хирургия. 2016;10(4):31–42.


5. Viardot A., Huber P., Puder J.J., et al. Reproducibility of nighttime salivary cortisol and its use in the diagnosis of hypercortisolism compared with urinary free cortisol and overnight dexamethasone suppression test. J Clin Endocrinol Metab. 2005;90(10):5730–36. Doi: 10.1210/jc.2004-2264.


6. Мельниченко Г.А., Дедов И.И., Белая Ж.Е. и др. Болезнь Иценко-Кушинга: клиника, диагностика, дифференциальная диагностика, методы лечения. Проблемы эндокринологии. 2015;61(2):55–7.


7. Penning T.M., Lee S.H., Jin Y., et al. Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of steroid hormone metabolites and its applications. J Steroid Biochem Mol Biol. 2010;121(3–5):546–55. Doi: 10.1016/j.jsbmb.2010.01.005.


8. McDonald J.G., Matthew S., Auchus R.J. Steroid profiling by gas chromatography-mass spectrometry and high performance liquid chromatography-mass spectrometry for adrenal diseases. Horm Cancer. 2011;2(6):324–32. Doi: 10.1007/s12672-011-0099-x.


9. Delivanis D.A., Athimulam S., Bancos I. Modern Management of Mild Autonomous Cortisol Secretion. Clin Pharmacol Ther. 2019;106(6):1209–21. Doi: 10.1002/cpt.1551.


10. Zografos G.N., Perysinakis I., Vassilatou E. Subclinical Cushing’s syndrome: current concepts and trends. Hormones (Athens). 2014;13(3):323–37. Doi: 10.14310/horm.2002.1506.


11. Великанова Л.И., Шафигуллина З.Р., Ворохобина Н.В. и др. Дифференциальная диагностика инциденталом надпочечников различными лабораторными технологиями. Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова. 2015;7(4):52–8.


12. Kerkhofs T.M.A., Kerstens M.N., Kema I.P., et al. Diagnostic value of urinary steroid profiling in the evaluation of adrenal tumors. HormCancer. 2015;6(4):168–75. Doi: 10.1007/s12672-015-0224-3.


13. Hines J.M., Bancos I., Bancos C., et al. High-Resolution, Accurate-Mass (HRAM) Mass Spectrometry Urine Steroid Profiling in the Diagnosis of Adrenal Disorders. Clin Chem. 2017;63(12):1824–35. Doi: 10.1373/clinchem.2017.271106.


14. Шафигуллина З.Р., Великанова Л.И., Ворохобина Н.В., и др. Диагностическое значение стероидных профилей биологических жидкостей у больных c синдромом Иценко-Кушинга. Проблемы эндокринологии. 2015;61(4):4–8.


15. Velikanova L.I., Strelnikova E.G., Obedkova E.V., et al. Generation of urinary steroid profiles in patients with adrenal incidentaloma using gas chromatography–mass spectrometry. J Anal Chem. 2016;71(7):748–54. Doi: 10.1134/S1061934816070169.


16. Ворохобина Н.В., Татаринова М.В., Великанова Л.И., Серебрякова И.П., Малеваная Е.В., Галахова Р.К. Особенности метаболизма стероидных гормонов у женщин репродуктивного возраста с различными формами гипрандрогении. Вестник Северо-Западного медицинского университета им. И.И. Мечникова. 2016;8(3):42–9.


Об авторах / Для корреспонденции


Автор для связи: Л.И. Великанова, д.биол.н., профессор, зав. научно-исследовательской лабораторией хроматографии, Северо-Западный 
медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия; velikanova46@gmail.com
Адрес: 191015, Россия, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, 41


ORCID: 
Л.И. Великанова (Velikanova L.I.), https://orcid.org/0000-0002-9352-4035 
З.Р. Шафигуллина(Shafigullina Z.R.), https://orcid.org/0000-0001-8292-8504 
Н.В. Ворохобина (Vorokhobina N.V.), https://orcid.org/0000-0002-9574-105X 
Е.В. Малеваная (Malevanaya E.V.), https://orcid.org/0000-0003-0880-0814 


Бионика Медиа