Роль микросателлитной нестабильности при ампулярной карциноме


О.В. Паклина (1, 3), Г.Р. Сетдикова (1), А.С. Даабуль (1), В.П. Шубин (2), Н.И. Поспехова (2), Д.Л. Ротин (3)

(1) ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина ДЗ Москвы; (2) ФГБУ «Государственный научный центр колопроктологии им. А.Н. Рыжих», Москва; (3) Московский клинический научный центр ДЗ Москвы
К ампулярным карциномам (АК) относят опухоли, связанные с дистальным отделом общего желчного протока и/или ампулярной частью главного панкреатического протока, а также большим дуоденальным сосочком. На долю АК приходится 0,5% от всех злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта. АК характеризуется наиболее высокими показателями 5-летней выживаемости (до 70%) и низкой частотой рецидивов. По данным литературы, многие авторы включают АК в группу опухолей с синдромом наследственного неполипозного колоректального рака, для которых характерны высокая частота микросателлитной нестабильности (МСН) из-за наличия герминальных мутаций в генах MSH2, MLH1, PMS2,MSH3, MSH6 и MLH3. Целью данной работы стала оценка частоты и клинико-биологического значения МСН в АК. Работа основана на операционном материале, полученном от 31 больного с АК, находившегося на лечении в учреждениях Москвы в 2003–2015 гг. Проведенное исследование показало, что в АК МСН присутствует в 16,7% спорадических карцином и характерна для опухолей с кишечным иммунофенотипом, встречаясь примерно с такой же частотой, как и при колоректальной карциноме. В единственном обнаруженном случае МСН высокого уровня с потерей белков репарации ДНК можно расценить как предиктивный фактор наследственного рака.

Под ампулярной карциномой (АК) подразумевают опухоли, анатомически связанные со следующими структурами [1]:

  • дистальный (интерстициальный) отдел общего желчного протока и/или ампулярная часть главного панкреатического протока – интраампулярный компонент;
  • большой дуоденальный сосочек (БДС).

На долю АК приходится 0,5% от всех злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта. Возраст больных варьируется в пределах 30–85 лет (медиана – 60 лет) с преобладанием мужчин в 1,5 раза [2]. АК характеризуется наиболее высокими показателями 5-летней выживаемости (до 70%) и низкой частотой рецидивов [3]. Несмотря на прогресс, достигнутый в изучении молекулярной онкологии, спектр выявленных молекулярных нарушений в АК на сегодняшний день ограничен [4–7].

В зависимости от различий в экспрессии муцинов 1-го, 2-го и 5АС-типов, среди АК гистологически различают кишечный и панкреато-билиарный типы [4].

По данным литературы, многие авторы включают АК в группу опухолей с синдромом наследственного неполипозного колоректального рака (ННКРР-HNPCC), для которых характерны высокая частота микросателлитной нестабильности (МСН) из-за наличия герминальных мутаций в генах MSH2, MLH1, PMS2,MSH3, MSH6 и MLH3 [8].

МСН (MSI), или феномен RER+-фенотипа (replication error), впервые описан в 1993 г. при изучении карцином толстой кишки [9]. МСН возникает вследствие нарушения системы репарации неспаренных оснований (mismatchrepair, MMR) и проявляется как накопление аллелей с измененной длиной коротких повторов ДНК в злокачественной опухоли.

В настоящее время общепринятым способом анализа RER+-фенотипа в опухолях является тестирование при помощи стандартного набора микросателлитных маркеров, одобренного экспертами Национального института рака США (NationalCancerInstitute, NCI). Рекомендуемая панель включает два квазимономорфных мононуклеотидных микросателлита (BAT25 и BAT26) и 3 динуклеотидных маркера (D5S346, D2S123,и D17S250). Принято выделять микросателлитные стабильные и нестабильные опухоли. Карциномы, демонстрирующие укорочение длины повторов по двум и более маркерам основной панели или имеющие более 30% нестабильных локусов при использовании большего числа маркеров, принято относить к случаям МСН высокого уровня (MSI-H), эквивалентной RER+-фенотипу.

В случае изменения длины только одного локуса из пяти в основной панели или менее 10–20% других маркеров было предложено использовать термин «низкий уровень МСН» (MSI-L) [10].

Частота МСН в АК варьируется от 12,5 до 22% (табл. 1). Тем не менее прогностическая значимость МСН в АК до конца не понятна.

С учетом этих данных целью настоящей работы стала оценка частоты и клинико-биологического значения МСН в АК.

Материал и методы

Работа основана на операционном материале, полученном от 31 больного АК, находившегося на лечении в учреждениях Москвы в 2003–2015 гг. Отмечено незначительное преобладание лиц мужского пола (1,3:1). Возраст больных колебался от 34 до 78 лет. Средний возраст мужчин составил 62, средний возраст женщин – 54 года.

Макроскопическое исследование резецированного органокомплекса проводили с использованием унифицированного алгоритма для АК [18]. Для дальнейшего микроскопического исследования материал фиксировали в 10%-ном забуференном растворе формалина, затем заливали в парафин по обычной методике. Серийные парафиновые срезы толщиной 3 мкм депарафинировали по стандартной схеме, окрашивали гематоксилином и эозином.

Выявление МСН в АК осуществлено в два этапа. На первом этапе применен иммуногистохимический метод – определен уровень белков системы репарации неспаренных оснований ДНК – MLH1, PMS2, MSH2, MSH6. В случае дефицита белков данной репаративной системы диагностировали МСН.

Дальнейшее подтверждение МСН проведено на образцах с наличием дефицита белков репаративной системы. Для молекулярного анализа в качестве источника ДНК использованы парафиновые блоки с помощью набора TIANampFFPEDNAKit (TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO, LTD, Китай). Образцы для молекулярного анализа содержали не менее 80% опухолевой ткани. В качестве контроля ДНК использовали неизмененную слизистую оболочку двенадцатиперстной кишки и лимфоциты в опухолевой ткани. Определение МСН проведено с помощью фрагментного анализа на приборе ABIPRISM 3500 (Life Technology, США). Использовали панель из 5 парных микросателлитных праймеров (NR21, NR24,BAT25, BAT26, BAT27).

Для определения микросателлитного статуса использовали те же критерии, что и для колоректального рака [19]:

  • МСТ высокого уровня (MSI-H) – не менее 30% используемых маркеров нестабильны;
  • МСТ низкого уровня (MSI-L) – нестабильны 10–30% маркеров;
  • микросателлитная стабильность (MSS).

Силу и значимость связи между анализируемыми признаками оценивали с помощью корреляционного-регрессионного анализа. Для количественных признаков вычисляли корреляционный коэффициент Пирсона. За уровень статистической значимости принимали р<0,05 с использованием пакета программ Statistica для MicrosoftWindows, версия 6.0.

Результаты

В результате проведенного исследования, согласно классификации Adsay V, установлено, что по локализации преобладали ампулярно-двенадцатиперстные АК – 67,7% случаев (21/31), реже встречались ампулярно-протоковые – 19,3% (6/31) и интраампулярные – 12,9% (4/31). По гистологическому типу в зависимости от экспрессии муцинов 1-го, 2-го и 5АС-типов преобладала группа с кишечным фенотипом – 67,7% (21/31), группа с панкреато-билиарным типом выявлена в 29% (9/31) случаев.

В одном случае обнаружена коэкспрессия маркеров как кишечной, так протоковой дифференцировки и опухоль расценивалась как смешанный тип АК. Следует отметить, что во всех случаях АК панкреато-билиарного типа экспрессия муцина 1 сочеталась с экспрессией муцина 5АС, т.е. «истинного» панкреато-билиарного типа с изолированной экспрессией муцина 1-го типа, более характерного при протоковом раке поджелудочной железы, не обнаружено.

При анализе морфологических данных была выявлена прямая корреляционная зависимость между макроскопическим и гистологическим типами АК (r=0,67; р=0,001). Так, для ампулярно-двенадцатиперстного макроскопического типа характерен был кишечный гистологический тип, а для ампулярно-протокового – панкреато-билиарный.

В 90,3% (28/31) случаев АК была представлена местно-распространенными формами: рТ2-инвазия в стенку двенадцатиперстной кишки обнаружена в 35,5% (11/31) случаев; рТ3-инвазия в поджелудочную железу – в 41,9% (13/31); рТ4 – в 12,9% (4/31).

И лишь в 9,7% (3/31) случаев опухоль не выходила за пределы ампулы БДС.

При определении уровня белков системы репарации неспаренных оснований ДНК дефицит белков диагностирован в 41,9% (13/30) случаев. При этом в большинстве (8/13) случаев обнаружен дефицит основания в гене PMS2. Сочетания MLH1/PMS2 (2/13) и MSH2/MSH6 (3/13) встречались реже (рис. 1). Основные морфологические характеристики приведены в табл. 2.

Мы не выявили статистически значимой связи между морфологическими характеристиками опухоли и наличием дефицита гена ДНК.

Далее в этих 13 образцах провели молекулярный анализ (табл. 3). В двух случаях выявили статус MSI-L и только в одном – статус MSI-H (рис. 2). Опухоли со статусом MSI-L и микросателлитные стабильные опухоли были объединены в одну группу для удобства статистической обработки. Во всех случаях отсутствовали как семейный анамнез заболевания, так и синхронные/метахронные опухоли других локализаций.

Мутаций гена BRAF не было обнаружено ни в одном случае.

Заключение

Проведенное исследование показало, что в АК МСН присутствует в 16,7% спорадических карцином и характерна для опухолей с кишечным иммунофенотипом, встречаясь примерно с такой же частотой, что и при колоректальной карциноме [20]. Мутации гена BRAF в нашей серии не обнаружены.

В единственном обнаруженном случае МСН высокого уровня с потерей белков репарации ДНК можно расценить как предиктивный фактор наследственного рака.


Литература


  1. Adsay V., Ohike N., Tajiri T., Kim G.E., Krasinskas A., Balci S., Bagci P., Basturk O., Bandyopadhyay S., Jang K.T., Kooby D.A., Maithel S.K., Sarmiento J., Staley C.A., Gonzalez R.S., Kong S.Y., Goodman M. Ampullary Region Carcinomas. Definition and Site Specific Classification With Delineation of Four Clinicopathologically and Prognostically Distinct Subsets in an Analysis of 249 Cases. Am. J. Surg. Pathol. 2012;36(11):1592–608.
  2. Kim R.D., Kundhal P.S., McGilvray I.D., Cattral M.S., Taylor B., Langer B., Grant D.R., Zogopoulos G., Shah S.A., Greig P.D., Gallinger S. Predictors of failure after pancreaticoduodenectomy for ampullary carcinoma. J. Am. Coll. Surg. 2006;202:112–19.
  3. Kimura W., Futakawa N., Zhao B. Neoplastic diseases of the papilla of Vater. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 2004;11:223–31.
  4. Паклина О.В., Кармазановский Г.Г., Сетдико-ва Г.Р. Патоморфологическая и лучевая дигностика хирургических заболеваний поджелудочной железы. М., 2013. 181 с.
  5. Achille A., Baron A., Zamboni G., Di Pace C., Orlandini S., Scarpa A. Chromosome 5 allelic losses are early events in tumours of the papilla of Vater and occur at sites similar to those of gastric cancer. Br. J. Cancer. 1998;78:1653–60.
  6. Moore P.S., Orlandini S., Zamboni G., Capelli P., Rigaud G., Falconi M., Bassi C., Lemoine N.R., Scarpa A. Pancreatic tumours: molecular pathways implicated in ductal cancer are involved in ampullary but not in exocrine nonductal or endocrine tumorigenesis. Br. J. Cancer. 2001;84:253–62.
  7. Nakata B., Wang Y.Q., Yashiro M., Nishioka N., Tanaka H., Ohira M., Ishikawa T., Nishino H., Hirakawa K. Prognostic value of microsatellite instability in resectable pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 2002;8:2536–40.
  8. Lin K.M., Shashidharan M., Thorson A.G., Ternent C.A., Blatchford G.J., Christensen M.A., Watson P. Cumulative incidence of colorectal and extracolonic cancers in MLH1 and MSH2 mutation carriers of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. J. Gastrointest. Surg. 1998;2:67–71.
  9. Boland C.R., Thibodeau S.N., Hamilton S.R., Sidransky D., Eshleman J.R., Burt R.W., Meltzer S.J., Rodriguez-Bigas M.A., Fodde R., Ranzani G.N., Srivastava S. A National CancerInstitute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detectionand familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 1998;58:5248–57.
  10. Кулигина Е.Ш., Соколенко А.П., Григо-рьев М.Ю. и др. Анализ RER+ фенотипа в билатеральных и монолатеральных карциномах молочной железы. Сибирский онкологический журнал. 2008;2:55–61.
  11. Imai Y., Tsurutani N., Oda H., Inoue T., Ishikawa T. Genetic instability and mutation of the TGF-beta-receptor-II gene in ampullary carcinomas. Int. J. Cancer. 1998;76:407–11.
  12. Scarpa A., Di Pace C., Talamini G., Falconi M., Lemoine N.R., Iacono C., Achille A., Baron A., Zamboni G. Cancer of the ampulla of Vater: chromosome 17p allelic loss is associated with poor prognosis. Gut. 2000;46:842–48.
  13. Suto T., Habano W., Sugai T., Uesugi N., Kanno S., Saito K., Nakamura S. Infrequent microsatellite instability in biliary tract cancer. J. Surg. Oncol. 2001;76:121–26.
  14. Rashid A., Ueki T., Gao Y.T., Houlihan P.S., Wallace C., Wang B.S., Shen M.C., Deng J., Hsing A.W. K-ras mutation, p53 overexpression, and microsatellite instability in biliary tract cancers: a populationbased study in China. Clin. Cancer Res. 2002;8:3156–63.
  15. Park S., Kim S.W., Kim S.H., Lee B.L., Kim W.H. Loss of heterozygosity in ampulla of Vater neoplasms during adenoma-carcinoma sequence. Anticancer Res. 2003;23:2955–59.
  16. Ruemmele P., Dietmaier W., Terracciano L., Tornillo L., Bataille F., Kaiser A., Wuensch P.H., Heinmoeller E., Homayounfar K., Luettges J., Kloeppel G., Sessa F., Edmonston T.B., Schneider-Stock R., Klinkhammer-Schalke M., Pauer A., Schick S., Hofstaedter F., Baumhoer D., Hartmann A. Histopathologic Features and Microsatellite Instability of Cancers of the Papilla of Vater and Their Precursor Lesions. Am. J. Surg. Pathol. 2009;33:691–704.
  17. Паклина О.В., Сетдикова Г.Р. Вестник ВГМУ. 2015;3(55):121–28.
  18. Umar A., Boland C.R., Terdinam J.P., Syngal S., de la Chapelle A., Rüschoff J., Fishel R., Lindor N.M., Burgart L.J., Hamelin R., Hamilton S.R., Hiatt R.A., Jass J., Lindblom A., Lynch H.T., Peltomaki P., Ramsey S.D., Rodriguez-Bigas M.A., Vasen H.F., Hawk E.T., Barrett J.C., Freedman A.N., Srivastava S. Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome) and microsatellite instability. J. Natl. Cancer Inst. 2004;96:261–68.
  19. Bosman F.T. WHO Classification of tumors of the digestive system Lyon, 2010.


Об авторах / Для корреспонденции


Д.Л. Ротин – д.м.н., зав. патологоанатомическим отделом Московский клинический научный центр ДЗ Москвы;e-mail: d.rotin@mknc.ru


Бионика Медиа