Identification Of Intestinal Bacteria Toxins Markers For Acute Intestinal Infections Diagnostics And Evaluation Of Treatment Efficacy


O.Belaya, N.Gyulazyan, N.Andrekaite

Identification of intestinal bacteria toxins markers for acute intestinal infections diagnostics and evaluation of treatment efficacy

Кишечные инфекционные заболевания имеют высокую социально-экономическую значимость и продолжают оставаться актуальной проблемой здравоохранения во всем мире в связи с высокой заболеваемостью, смертностью, трудностями диагностики, а также триггерным действием на
развитие патологических синдромов, иммунодефицитных, аллергических и аутоиммунных состояний. В структуре инфекционной патологии острые кишечные инфекции (ОКИ) занимают одно из ведущих мест [1].

Полиэтиологичность большинства ОКИ и присутствие у возбудителей широкого спектра антигенов, токсинов и ферментов обусловливают одновременное или последовательное воздействие на организм человека нескольких факторов патогенности с различными механизмами действия [2–5]. Наиболее мощным эффектом среди них обладают липополисахариды, сходные с ними по действию компоненты грамположительных возбудителей, а также экзотоксины.

Особенности воздействия возбудителей и их факторов патогенности (отдельных и в совокупности) на макроорганизм в конкретных условиях инфекционного заболевания изучены недостаточно в связи с ограниченными возможностями используемых методов, их сложностью и малой доступностью. В современных условиях все большую значимость приобретает необходимость понимания того, каким образом энтеропатогенные возбудители способны вызывать развитие заболеваний и влиять на характер клинического течения, в т. ч. микстинфекций, в условиях формирования и распространения клонов возбудителей с полирезистентностью к антимикробным препаратам, постоянного изменения этиологической структуры, роста числа смешанных бактериально-бактериальных, бактериально-вирусных инфекций и необходимости более осторожного и дифференцированного подхода к вопросам лечения и профилактики.

В связи с этим несомненный интерес представляет изучение экзотоксинов в биосредах организма больных при кишечных инфекционных заболеваниях, а именно – их присутствия, уровня и динамики, соотношений с выраженностью синдрома интоксикации, уровнями иммунных комплексов, спектром, уровнями, динамикой про- и противовоспалительных цитокинов, другими факторами клеточного, а также гуморального иммунного ответа.

Цель работы – выявление маркеров токсинов кишечных бактерий у больных ОКИ для диагностики и оценки эффективности лечения.

Материал и методыисследования

Проведено клинико-лабораторное обследование 273 больных ОКИ различной этиологии средней тяжести течения. В остром периоде заболевания бактериологическое подтверждение диагноза получено у 14,7 % пациентов: у 12,5 % обнаружены сальмонеллы, у 2,2 % – шигеллы, у остальных 85,3 % больных диагноз бактериологически не подтвердился (БПОНЭ – бактериальное пищевое отравление неустановленной этиологии). Исследования проведены в остром периоде (1–3-й дни), в динамике болезни (4–6-й дни) и в период ранней реконвалесценции (7–9-й дни).

В качестве дополнительного метода расшифровки этиологии ОКИ мы использовали реакцию коагглютинации (РКА) на стекле с набором антительных диагностикумов для выявления в качестве маркеров возбудителей О-антигенов (О-АГ) S. sonnei, S. flexneri 1–6, S. dysenteriae 1, Salmonella В, С1,
С2, D, E серогрупп, Y. pseudotuberculosis І и ІІІ, Y. enterocolitica О3, О7,8, О9, О4, 33, О6, 30, Campylobacter (C. jejuni, C. coli, C. lari), V. сholerae 01, а также РКА на планшете для выявления маркеров Шига токсина (ШТ), токсинов А и В C. difficile, энтеротоксина типа А C. perfringens, холероподобного энтеротоксина (диагностикумы были изготовлены и любезно предоставлены ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН). Выявление маркеров токсинов проведено в пробах копрофильтратов (КФ) и в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), осажденных из сыворотки крови с использованием 5 %-ного полиэтиленгликоля 6000 [6–8].

Количественное содержание интелейкина-1β (ИЛ-1β), фактора некроза опухоли (ФНО) α, ИЛ-4 и ИЛ-10 в сыворотке крови определено у 180 больных в разгар заболевания иммуноферментным анализом (тест-системы ООО “Протеиновый контур” СПб.). Также проведены традиционные бак-
териологические исследования, общеклинические анализы крови и мочи, по показаниям – копрологическое и биохимические исследования, ультразвуковое исследование органов брюшной полости, гастроскопия, колоно-, ректороманоскопия и ЭКГ.

С целью оценки основных объективных симптомов интоксикации и диарейного синдрома учитывали максимальную высоту и длительность лихорадки, частоту стула и общую длительность диареи, а также количество лейкоцитов и лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) в разгар болезни (1–3-й дни).

Статистическая обработка данных была выполнена по программам Microsoft Excel и Statistica 6.0, “Biostat” для IBM PC. Использованы параметрические и непараметрические критерии-χ2 Стьюдента, корреляционный анализ.

Результаты и обсуждение

Этиологическая структура ОКИ (n = 273) подтверждена в общей сложности бактериологически и по выявлению О-АГ, а также маркеров токсинов возбудителей у 94,9 % больных: у 11,0 % выявлен О-АГ одного возбудителя либо маркер одного токсина клостридий, т. е. диагностирована моноинфекция, у 229 (83,9 %) установлено смешанное инфицирование (микст-АГ), у остальных (5,1 %) пациентов этиология заболевания не выявлена.

В целом О-АГ разных кишечных возбудителей выявлены в парных пробах КФ (в разгар заболевания и в период ранней реконвалесценции) в 90,1 % случаев, в виде моно-О-АГ – в 9,9 %, микстО-АГ – в 18,7 %, в сочетании с токсинами – в 61,5 %. О-АГ S. dysenteriae 1 и V. сholerae 01 найдены не были.

Маркеры токсинов в условно принятом нами диагностическом титре 1 : 8 были найдены всего у 67,8 % больных. Маркеры ШТ найдены в 24,4 % проб КФ, токсина А C. difficile – в 29,4 %, токсина В C. difficile – в 23,2 %, энтеротоксина А C. perfringens – в 32,9 % и холероподобного энтеротоксина
(ХЭТ) – в 12,1 % проб КФ. Достоверно чаще были выявлены токсины А C. difficile и C. perfringens (р < 0,05), реже – ХЭТ (р < 0,05) в сравнении с остальными токсинами. У 16,5 % больных титры токсинов были очень высокими (1 : 512 и выше). Частота одновременного выявления 3 и более маркеров токсинов в одной пробе КФ составила 46,5 %. В основном (66,7 %), выявлены различные сочетания токсинов А и/или В C. difficile с А C. perfringens и/или ШТ (в сочетании с токсинами клостридий – у 64,5 %). К моменту выписки из стационара (6–10-й дни болезни) у 34 больных в кале сохранялись АГ токсинов клостридий в повышенном титре (12,5 %).

Таким образом, очевидно преимущество метода РКА для этиологической расшифровки ОКИ. Так, если по данным бактериологического исследования этиология заболевания была установлена у 14,7 % больных, при определении О-АГ или маркеров токсинов с использованием РКА в результате исследований двух проб КФ подтверждение диагноза получено в 94,9 % случаев.

Сравнительный анализ симптомов интоксикации и диареи в зависимости от присутствия у них моно- или микстмаркеров токсинов и О-АГ возбудителей показал, что высота температуры в сравниваемых группах достоверно не различалась, лихорадка была несколько длительнее при воздействии миксттоксинов (р > 0,05). Частота стула в группе больных с монотоксином в разгар болезни была достоверно выше, чем в группах с микст-токсинами и сочетанием токсина C. perfringens А с О-АГ (5,9 ± 0,9; р < 0,05). Диарея была длительнее в группе больных с микст-О-АГ (р > 0,05). Интересен тот факт, что максимальное значение ЛИИ выявлено в группе с маркерами разных токсинов (35,3 ± 19,4), что достоверно выше, чем при сочетанном влиянии токсинов и О-АГ разных возбудителей (р < 0,03; табл. 1).

Таблица 1. Клинико-лабораторные особенности течения ОКИ при наличии токсинов и/или О-АГ.

Детальный анализ показателей диарейного синдрома (боли в области живота, характер стула и присутствие в нем патологических примесей) показал, что во всех группах больных чаще отмечаются обильный водянистый стул (р < 0,05), боли в животе различного характера и интенсивности, однако более яркие проявления колита и гемоколита отмечены при микст-О-АГ и их сочетании с токсинами (табл. 2).

Таблица 2. Характер диарейного синдрома в зависимости от присутствия токсинов и/или О-АГ.

Мы полагаем, что выявление маркеров токсинов клостридий даже в небольших титрах должно привлекать к себе внимание, т. к. свидетельствует о присутствии в кишечнике этих токсинпродуцирующих бактерий, способных при благоприятных условиях (нарастание дисбиоза, антибиотикотерапия и др.) быстро увеличивать продукцию токсина с возможным развитием псевдомембранозного колита [4].

ШТ считается наиболее распространенным токсином, встречающимся у S. dysenteriae 1 и их О–-мутантов, S. flexneri различных сероваров, кроме VІ, E. coli, сальмонелл и йерсиний псевдотуберкулеза, V. cholerae, V. parahaemolyticus, A. haemolyticus [9–13].

ХЭТ вырабатывается E. coli, представителями родов Escherichia, Salmonella, Campylobacter, Aeromonas, Vibrio. Продукция этих токсинов (ШТ и ХЭТ) может быть обусловлена также энтеробактериями, относящимися к группе условнопатогенных бактерий, исследования на наличие которых у взрослых больных проводятся редко (K. oxytoca, C. freundii, K. pneumoniae, E. cloacae, E. aerogenes spp. и др.) [14–15].

Впервые у больных ОКИ нами была изучена динамика изменений уровней в каждый из изучаемых периодов болезни маркеров ряда наиболее значимых токсинов, выступающих в качестве важных факторов патогенности в развитии кишечных инфекций, – ШТ, токсинов А и В C. difficile, энтеротоксина типа А C. perfringens и ХЭТ.

Детальное изучение динамики выявления маркеров токсинов в КФ свидетельствует о высокой частоте их выявления начиная с первых дней от начала заболевания с последующим снижением к ранней реконвалесценции, достоверным для C. perfringens А и ШТ (р < 0,05). Частота выявления всех токсинов в 1–3-й дни болезни была также выше, чем в последующие сроки исследования. На 4–6-й день АГ C. perfringens А выявлен достоверно чаще, чем ШТ и C. difficile (р < 0,05).

Максимальные уровни ШТ и токсина А C. perfringens были выявлены уже в первый день болезни, токсинов А и В C. difficile – на 2-й и только ХЭТ – на 3-й день. В динамике заболевания начиная с 4-го дня средние уровни маркеров всех токсинов снижались. В период ранней реконвалесценции (на 7–9-й дни) наблюдалось достоверное снижение уровня ШТ (р < 0,01), ХЭТ (р < 0,05), токсинов А C. perfringens и C. difficile (р < 0,05), кроме токсина В C. difficile.

Однако к моменту выписки из стационара АГ ШТ (4,0 %), ХЭТ (2,2 %) и токсинов клостридий (12,5 %) еще сохранялись в кале в диагностическом титре. Основываясь на предварительном анализе, при рассмотрении результатов определения цитокинов в сыворотке крови мы разделили всех пациентов на несколько групп в зависимости от выявленных уровней ИЛ-4 (табл. 3). В первую группу вошли больные с концентрациями ИЛ-4 от 0 до 4,9 пг/мл, во вторую – 5,0–29,9, в третью – 30,0–100,0 и в четвертую – 500,0 пг/мл и выше.

В этих группах больных, сформированных по уровню ИЛ-4, при анализе уровней и динамики токсинов, антигенной “нагрузки”, показателей ЛИИ и числа лейкоцитов, отмечены следующие тенденции. При подпороговых концентрациях ИЛ-4 (группа 1) уровни всех токсинов практически не изменялись в динамике заболевания. При сочетании ИЛ-4 с ИЛ-1β и ФНО-α в диагностических концентрациях их средние уровни колебались в небольшом диапазоне и имели тенденцию к понижению.

Более высокие средние концентрации ИЛ-4 наблюдались в группе 4 с достоверным преобладанием у больных числа проб с ростом титров токсинов над числом проб с падением титров токсинов; кроме того, отмечено снижение числа лейкоцитов в периферической крови (р < 0,02) и увеличение показателя ЛИИ, превысившее нормальные показатели уже при концентрации ИЛ-4 выше 30 пг/мл (р < 0,04), а также достоверное повышение уровней ИК в динамике заболевания (р < 0,05). При одинаковой “нагрузке” О-АГ (число выявленных О-антигенов разных возбудителей в
расчете на одну пробу копрофильтрата) токсическая “нагрузка” в группе с подпороговыми уровнями ИЛ-4 (5,0–29,9 пг/мл) растет, а в группе с уровнем ИЛ-4 свыше 500,0 пг/мл и высоких уровнях других цитокинов – падает (р < 0,05).

При анализе динамики уровней среднемолекулярных ИК в КФ в зависимости от периода заболевания в общей группе больных отмечено достоверное их нарастание к 4–6-му дню заболевания и в период реконвалесценции (7–9-й дни) по сравнению с 1–3-м днями (р < 0,02), однако в выделенных группах изменение уровней ЦИК в КФ было различным (табл. 3).

Таблица 3. Сравнительный анализ некоторых лабораторных показателей в группах больных с различными уровнями ИЛ-4.

С учетом того что с увеличением числа проб с ростом титров токсинов наблюдалось увеличение концентраций ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-4 в крови больных, а высокий уровень ИЛ-10 установлен только при концентрации ИЛ-4 выше 500 пг/мл, представляло интерес проследить корреляции различных уровней ИЛ-4 с другими ЦК. Оказалось, что уровни ИЛ-4 повышались с увеличением числа обнаруживаемых цитокинов (табл. 4).

Таблица 4. Уровни цитокинов и корреляции между ними в зависимости от их профиля.

При одновременном выявлении ИЛ-4 и ИЛ-1β корреляция их уровней была прямой и достоверной, а ИЛ-4 с ФНО-α –недостоверной. При высоких уровнях ИЛ-4 и ИЛ-1β отмечены достоверная корреляция ИЛ-4 со всеми цитокинами и отсутствие корреляции ИЛ-10 с ИЛ-1β, т. е. создавалось впечатление, что именно ИЛ-4 выступает в качестве “сторожевого” маркерного цитокина, умеренный уровень которого отражает присутствие провоспалительных цитокинов (ФНО-α и ИЛ-1β), а высокий уровень – присутствие противовоспалительного ИЛ-10.

В целом средние уровни маркеров токсинов в составе ЦИК сыворотки крови в течение заболевания имели монотонный характер. При этом только в отношении маркера ШТ была установлена достоверная прямая корреляция его уровня в составе ЦИК в период ранней реконвалесценции (4–7-й дни болезни) с уровнем маркера ШТ в КФ в разгар болезни (1–4-й дни болезни; r = 0,23, р = 0,005).

Представлял интерес анализ полученных данных с точки зрения влияния токсигенной нагрузки в организме (числа одновременно присутствующих в КФ маркеров токсинов без учета липополисахаридов) на уровни маркеров токсинов в составе ЦИК крови.

В результате такого анализа установлено, что титры маркера ТШ в ЦИК были достоверно выше в присутствии двух токсинов в кале, чем в присутствии одного токсина, а при трех и четырех – уровни маркера ШТ в ЦИК достоверно снижались. Похожая картина наблюдалась и при выявлении маркера токсина А C. difficile в составе ЦИК. При этом уровни маркеров остальных токсинов практически не зависели от числа токсинов в КФ. Общий уровень ЦИК был наиболее низким у больных с двумя-тремя токсинами в кале (табл. 5).

Таблица 5. Уровни маркеров токсинов в ЦИК в зависимости от токсигенной нагрузки в КФ (lg10 обратного титра маркера).

Это свидетельствовало о том, что увеличение токсигенной нагрузки негативно сказывается на продукции специфических антитоксических антител и, соответственно, на связывании ими токсинов возбудителей в ЦИК. Изучение частоты выявления маркеров токсинов возбудителей в составе
ЦИК у больных ОКИ на фоне лечения ципрофлоксацином (64 пациента) и без такового (76 пациентов) показало, что частота обнаружения их в составе ЦИК сыворотки крови в титре ≥ 1 : 4 была в группах практически одинаковой. При этом наиболее часто выявлялся маркер ШТ (84 и 86 %), реже – маркеры других токсинов (C. perfringens – 70 и 63 %, В C. difficile – 48 и 58 %, А C. difficile – 13 и 22 %, ХЭТ – 5 и 8 % соответственно). По отдельным дням болезни достоверных различий между группами частоте выявления маркеров токсинов не отмечено. Это свидетельствовало об отсутствии выраженного влияния ципрофлоксацина на частоту выявления маркеров токсинов в ЦИК, т. е. на частоту формирования специфических антитоксических ЦИК у больных ОКИ.

При исследовании уровней маркеров токсинов в составе ЦИК сыворотки крови у больных ОКИ установлено, что в целом вне связи с проводимым лечением в разгар заболевания (3–4-й дни болезни) титры маркера ШТ были наиболее высокими и позже практически не снижались, несколько ниже были титры маркера токсина C. perfringens, достоверно ниже – титры маркера токсина В C. difficile, а маркеры токсина А C. perfringens и ХЭТ практически не определялись.

Достоверные различия между группами отмечены по уровню маркера ШТ: выше – при обследовании на 5-й день болезни (р = 0,01), ниже – на 7-й день болезни и позже (р = 0,04) в 1-й группе больных, леченных ципрофлоксацином, по сравнению со 2-й группой больных без такового. Кроме того, уровни маркера токсина В C. difficile в 1-й группе на 5-й день болезни были достоверно ниже, чем на 3–4-й и 6-й дни, а во 2-й группе они достоверно увеличивались в течение первых 6 дней болезни.

Это указывает на то, что при лечении ОКИ ципрофлоксацином существует тенденция к росту уровня маркера ШТ в ЦИК, а при терапии без данного препарата – к падению указанного показателя. Кроме того, отмечаются более высокие уровни маркера токсина В C. difficile в составе ЦИК к концу 1-й недели болезни.

На фоне лечения ципрофлоксацином происходила быстрая элиминация О-АГ возбудителей при исследовании КФ, но при этом происходило усиление образования Шига-специфических ЦИК, что, возможно, обусловлено увеличением продукции ШТ в кишечнике. Как свидетельствуют литературные
данные [16], хинолоновые препараты воспринимаются микроорганизмом как стресс-фактор и в ответ на это он начинает усиленно передавать ген шигаподобного токсина другим микробам, в т. ч. из состава нормальной флоры кишечника, с последующим увеличением продукции токсинов данной
группы. При этом высокие уровни шигаподобных токсинов в кале больных рассматриваются в качестве предиктора развития гемолитико-уремического синдрома [17].

Выводы

1. У больных ОКИ О-АГ шигелл Зонне, Флекснера, Ньюкастл, сальмонелл В, С1, С2, D, E серогрупп, йерсиний псевдотуберкулеза І и ІІІ, энтероколитика О3, О7, 8, О9, О4, 33, О6, 30 и кампилобактерий выявлены в 90,1 %, а в сочетании с токсинами – в 61,5 % случаев, что значительно превышает диагностические возможности бактериологического исследования. К моменту выписки из стационара маркеры токсинов сохранялись в кале у 12,5 % больных.
2. В разгар ОКИ отмечены наиболее высокие уровни маркеров ШТ, токсина А C. difficile и C. perfringens, более низкие – токсина В C. difficile и ХЭТ. Уровни маркеров токсинов коррелировали между собой (r = 0,32–0,89, р < 0,01) и частотой их выявления; в динамике заболевания они снижались.
3. Сочетанное присутствие у больных О-АГ и маркеров токсинов нескольких возбудителей сопровождается более выраженными клиническими проявлениями болезни (длительная и частая диарея, лихорадка, сильный болевой синдром, появление патологических примесей в стуле) и высо-
ким ЛИИ в сравнении с больными, у которых обнаружен маркер одного токсина.
4. С целью верификации диагноза ОКИ, выявления микст-инфекций и труднодиагностируемых заболеваний (йерси-ниозы, кампилобактериозы, клостридиозы) целесообразно использовать широкий спектр диагностических тестсистем для выявления маркеров экзотоксинов (ШТ токсина, энтеротоксинов А и В C. difficile, энтеротоксина А C. perfringens, ХЭТ) и О-АГ (шигелл Зонне, Флекснера, Ньюкастл, сальмонелл В, С1, С2, D, E серогрупп, йерсиний псевдотуберкулеза І и ІІІ, а также энтероколитика О3, О7, 8, О9, О4, 33, О6, 30, кампилобактерий).
5. При увеличении токсигенной нагрузки на организм (до трех-четырех токсинов в кале) происходит снижение уровней маркеров ШТ и токсина А C. difficile в составе ЦИК.
6. При лечении ОКИ ципрофлоксацином существует тенденция к росту, а при лечении без использования ципрофлоксацина – к падению уровня маркера ШТ в составе ЦИК крови. Полное прекращение выявления в КФ О-АГ и токсинов может служить показателем высокой эффективности
проведенного лечения.


Similar Articles


Бионика Медиа