Bronchopulmonary dysplasia in children in terms of genetic variability of the vitamin D receptor


DOI: https://dx.doi.org/10.18565/pharmateca.2020.10.94-99

D.F. Sergienko, P.B. Khishtilova

Astrakhan State Medical University, Department of Faculty Pediatrics, Astrakhan, Russia
Background. In addition to the main function of regulating calcium-phosphorus metabolism, vitamin D (VD) and its receptor (VDR) have an indirect effect on more than 300 genes that affect the cell cycle, immunity and metabolism. Of more than 30 known single nucleotide sequences, ApaI (rs7975232), BsmI (rs1544410), FokI (rs2228570), TaqI (rs731236), and Cdx2 (rs11568820) are the most studied and have phenotypic effects on a number of diseases.
Objective. Determination of the effect of the VDR gene FOK1 polymorphism on the course and outcomes of bronchopulmonary dysplasia (BPD) in children.
Methods. The main group in the study consisted of 80 patients with a diagnosis of bronchopulmonary dysplasia (BPD). The control group consisted of 93 preterm infants without BPD. All patients of the main group were examined and received treatment in accordance with the standard of medical care for this disease. To perform molecular genetic analysis, total DNA was isolated from whole blood. Genotyping of polymorphic markers of the studied genes was carried out using polymerase chain reaction (PCR) and analysis of restriction fragment length polymorphism (RFLP analysis). Statistical analysis was carried out by methods of variation statistics.
Results. The association of the VDR gene FOK1 polymorphism with the implementation of BPD in children has been proven. According to statistical analysis, the F/F genotype predisposes to the development of the disease (χ2=7.133; p=0.008, df=1, OR=2.811, CI: 1.300–6.077). The evaluation of the effect of genotypes of the VDR gene FOK1 polymorphism on the outcomes of BPD, the severity and the implementation of broncho-obstructive syndrome in BPD exacerbation, the nature of the airway microbiota and the duration of IGCS use did not reveal statistically significant differences. At the same time, a comparative analysis of the data showed that heterozygous carriers of the F/f genotype of the VDR gene FOK1 polymorphic marker significantly more often had severe lesions of the central nervous system – CNS (χ2=7.619; p<0.05, p=0.006, df=1, odds ratio [OR]=9,000, confidence interval [CI]: 1.638–49.447). Analysis of the data obtained revealed a significant relationship between the heterozygous F/f genotype of the VDR gene FOK1 polymorphic marker with the incidence of acute respiratory viral infections (ARVI) (χ2=3.889; p=0.049, df=2), as well as with the appearance of the first episodes of ARVI in children up to 1-year old (χ2=7.347; p<0.05, p=0.020).
Conclusion. The results of the study proved that the homozygous F/F genotype is predisposing to the formation of BPD in infants. The heterozygous F/f genotype of the VDR gene FOK1 polymorphic locus is associated with vascular lesions of the central nervous system, frequent episodes and early onset of viral infections, accompanied by a severe form of obstructive syndrome in children with BPD.
Keywords: bronchopulmonary dysplasia, vitamin D receptor, FOK1 polymorphism

Введение

Помимо основной функции, заключающейся в регуляции фосфорно-кальциевого обмена, витамин D (VD) и его рецептор (VDR) оказывают опосредованное влияние более чем на 300 генов, влияющих на клеточный цикл, иммунитет и метаболизм [1]. Доказано, что активная форма витамина D оказывает прямое воздействие на недифференцированные и инактивированные Т-хелперы, Т-регуляторы, активированные Т-клетки и дендритные клетки [1, 2].

Ген VDR находится на коротком плече хромосомы 12 (12q13.1), состоит из 9 экзонов и 8 интронов. Он имеет высокую вариабельность полиморфных последовательностей, возникающих как в кодирующих, так и в некодирующих частях гена, и это ведет к изменениям его функции за счет активации экспрессии гена, реже – к структуре белка. Более чем из 30 известных однонуклеотидных последовательностей наиболее изученные ApaI (rs7975232), BsmI (rs1544410), FokI (rs2228570), TaqI (rs731236) и Cdx2 (rs11568820) [2]. Установлено их влияние на риск развития, тяжесть и течение иммуноопосредованных заболеваний, таких как сахарный диабет и ревматоидный артрит, хронические бронхолегочные и сердечно-сосудистые недуги. Полученные результаты исследований свидетельствуют о необходимости проведения дальнейших изысканий в этой области [2–6].

Цель исследования: определить влияние полиморфизма FOK1 гена VDR на течение и исходы бронхолегочной дисплазии (БЛД) у детей.

Методы

Исследование проведено на базе ГБУЗ АО ОДКБ им. Н.Н. Силищевой, Астрахань, в период с 2016 по 2019 г.

Основную группу составили 80 пациентов с диагнозом БЛД. Группа контроля представлена 93 недоношенными новорожденными, не сформировавшими диагноз БЛД. Все пациенты основной группы обследованы и получали лечение, согласно стандарту оказания медицинской помощи при данном заболевании.

Для выполнения молекулярно-генетического анализа производили выделение тотальной ДНК из цельной крови. Генотипирование полиморфных маркеров изучаемых генов осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализа) У пациентов с различными аллелями и генотипами анализировались следующие параметры: степень тяжести заболевания, длительность респираторной поддержки, гендерный признак, варианты исходов недуга, частота, тяжесть обострений и респираторных инфекций, заинтересованность в базисной терапии, коморбидные состояния, показатели функции внешнего дыхания по данным бронхофонограммы и интерпретация данных компьютерной томограммы легких.

Для сравнения частот аллелей и генотипов и их ассоциации с фенотипом БЛД использовали χ2-критерий Пирсо с поправкой Йетса на непрерывность при числе степеней свободы, равном 1, а также двусторонний точный тест Фишера в случае, если ожидаемое значение хотя бы в одной ячейке таблицы сопряженности было меньше 5.

Об ассоциации фенотипического признака с конкретным генотипом или аллелей судили по величине отношения шансов (Оdds Ratio [OR]).

Результаты

В ходе исследования выявлено, что генотипическая вариабельность полиморфизма FOK1 гена VDR у пациентов представлена таким образом, что наиболее часто идентифицирован генотип F/F – в 65,0% случаев (52 ребенка), в то время как в контрольной группе – лишь в 39,8% (37 детей). Частота встречаемости гетерозиготного генотипа F/f у детей контрольной группы составила 45,2% (42 ребенка), в основной – 30,0% (24 пациента). Гомозиготное состояние мутантного аллеля f гена VDR обнаруженo у здоровых младенцев в 15,0% (14 детей), в то время как среди детей с БЛД – в 5,0% (2 пациента) обследованных (табл. 1).

96-1.jpg (62 KB)

Таким образом, доказана ассоциация полиморфизма FOK1 гена VDR с реализацией БЛД у детей. Согласно статистическим данным, генотип F/F предрасполагает к развитию заболевания (χ2=10,946; р<0,001, df=1, OШ=2,811, ДИ: 1,513–5,221). Получена ассоциация аллеля F с развитием заболевания (OШ=1,924, ДИ: 1,108–3,342).

Поскольку степень тяжести БЛД имеет основополагающее значение для фенотипической характеристики заболевания и варианта его исхода, мы проанализировали влияние полиморфизма FOK1 гена VDR на данный классификационный критерий. В ходе сравнительного анализа распределения частот аллелей (F, f) и генотипов (F/F, F/f, f/f) выявлено достоверное различие между группами пациентов с легкой, среднетяжелой и тяжелой формами БЛД. Так, в группе детей со средней степенью тяжести преобладали пациенты с генотипом F/f (χ2=7,561, р=0,023, df=2, OШ=3,661, ДИ: 1,317–10,205, табл. 2).

96-2.jpg (114 KB)

Изучение влияния полиморфизмов FOK1 гена VDR на исходы бронхолегочной дисплазии у детей, а именно частоту выздоровления или формирование хронического бронхолегочного процесса, не выявило статистически значимых различий (табл. 3).

В ходе исследования была выявлена высокая частота поражений нервной системы в виде церебральной ишемии, внутрижеледочковых кровоизлияний I–III степеней, перивентрикулярной лейкомаляции. Сравнительный анализ данных показал, что у гетерозиготных носителей генотипа F/f полиморфного маркера FOK1 гена VDR достоверно чаще имелись тяжелые поражения ЦНС (χ2=15,238; р<0,001, df=1, OШ=9,000, ДИ: 1,638–49,447).

Анализ полученных данных выявил достоверную взаимосвязь гетерозиготного генотипа F/f полиморфного маркера FOK1 гена VDR с частотой ОРВИ (χ2=7,778; p<0,05, р=0,006, df=1), а также наличием первых эпизодов ОРВИ до года (χ2=14,694; p<0,05, р<0,001, df=1).

97-1.jpg (60 KB)

Таким образом, генотип F/f служит предрасполагающим генетическим фактором к раннему старту (до года) и высокой частоте респираторно-вирусных инфекций у детей с БЛД (OШ=5,000, ДИ: 0,923–27,079; табл. 5, 6).

97-2.jpg (115 KB)

Респираторные инфекции у детей с БЛД сопровождаются развитием бронхообструктивного синдрома (БОС), что требует проведения лечебных мероприятий с включением бронхолитиков и ингаляционных глюкокортикостероидов (ИГКС). В зависимости от частоты и тяжести БОС пациенты получали ингаляционную терапию либо краткосрочным курсом, либо (в случае частых эпизодов) длительно. При поиске ассоциаций генотипов F/F, F/f и f/f с возможностью реализации БОС при обострении БЛД и длительностью использования ИГКС достоверных различий не выявлено (χ2=1,474; р=0,479; χ2=5,519; р=0,064 соответственно) (табл. 7, 8).

98-1.jpg (184 KB)

Согласно проведенному статистическому анализу, генотип F/f является предрасполагающим к тяжелому течению БОС во время обострения БЛД (χ2=35,4676; р=0,002, OШ=18,000, ДИ: 4,728–68,533; табл. 9).

Функциональные методы исследования функции внешнего дыхания (ФВД) служат основополагающим диагностическим инструментом при диагностике степени и характера изменения у пациентов с острой и хронической бронхолегочной патологией. Проведен анализ спектра и выраженности изменений, согласно данным бронхофонограммы. Согласно статистическому анализу, у детей с легкими нарушениями ФВД в 100% (12 детей) идентифицирован генотип F/F, в то время как в группе пациентов с умеренными и выраженными нарушениями генотипы распределились равномерно. Ассоциации генотипов F/F, F/f, f/f и аллелей F и f полиморфизма FOK1 гена VDR с уровнем поражения дыхательных путей, а именно верхних, средних и нижних, выявлено не было (χ2=4,347; p>0,05; р=0,362; df=4) (табл. 10, 11).

98-2.jpg (56 KB)

При генетической вариабельности полиморфизма FOK1 гена VDR не получено статистически значимых различий по влиянию генотипов на характер микробиоты дыхательных путей у детей с БЛД (табл. 12).

99-1.jpg (53 KB)

Обсуждение

В ходе исследования выявлена ассоциация полиморфизма FOK1 гена VDR с формированием БЛД у детей. По всей видимости, данная ассоциация связана с моделирующим влиянием полиморфизма на уровень VD, который может оказывать влияние на степень созревания легочной ткани и темпы альвеолярной васкуляризации [10].

В то же время, не было определено влияние полиморфизма FOK1 гена VDR на степень тяжести и варианты исходов БЛД, что требует дальнейшего изучения.

Поражения центральной нервной системы (ЦНС) могут обусловливать тяжесть течения и неблагоприятный исход заболевания, что связано с нарушением регуляции дыхательных паттернов, тонуса бронхиальных сосудов и просвета бронхов, а также изменение секреторной активности бокаловидных клеток по средствам дезрегуляции вегетативной нервной системы. В ходе исследования была выявлена высокая частота поражений нервной системы в виде церебральной ишемии, внутрижеледочковых кровоизлияний I–III степеней, перивентрикулярной лейкомаляции. Сравнительный анализ данных показал, что у гетерозиготных носителей генотипа F/f полиморфного маркера FOK1 гена VDR достоверно чаще имелись тяжелые поражения ЦНС. Согласно данным литературы, в российской популяции пациентов с артериальной гипертензией проведено изучение распределения генотипов FokI гена VDR, и установлено, что у лиц с F/F- и F/f-генотипами заболевание стартовало в более раннем возрасте по сравнению с индивидуумами, имевшими генотип f/f. Описано, что неврологические расстройства, связанные с дефицитом витамина D, включают цереброваскулярные патологии (сосудистая деменция, ишемический инсульт), рассеянный склероз (в т.ч. более высокую частоту рецидивов и большее число поражений, устанавливаемых по МРТ), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, атеросклероз сонных артерий и эпилепсию [3–6]. Возможно, васкулярные изменения, ассоциированные с данным полиморфизмов, служат одной из причин высокой частоты встречаемости поражение ЦНС у недоношенных младенцев с БЛД.

Обострение БЛД, как правило, ассоциировано с присоединением респираторной вирусной инфекции. В то же время частота и тяжесть ОРВИ непосредственно влияют на исход БЛД. Согласно данным многочисленных исследований, ядерный рецептор витамина D оказывает прямое воздействие на недифференцированные и инактивированные Т-хелперы, Т-регуляторы, активированные Т-клетки и дендритные клетки. Приняв это во внимание, мы провели поиск ассоциации полиморфизма FOK1 гена VDR на частоту и старт вирусных инфекций у детей основной группы [1, 7, 8].

В ходе исследования было показано, что генотип F/f служит предрасполагающим генетическим фактором к раннему старту (до года) и высокой частоте респираторно-вирусных инфекций у детей с БЛД. По всей видимости, моделирующее влияние полиморфизма на частоту респираторных заболеваний связана с модификацией защитного эффекта витамина D на клетки макрофагов, «работающих» совместно с клетками эпителия дыхательных путей. В ряде работ показано, что активная форма VD, способная подавлять избыточную воспалительную реакцию на вирусы, может быть подвергнута генетической вариабельности.

По данным литературы, витамин D поддерживает антибактериальный и антивирусный иммунитет в легочной ткани. На фоне дефицита повышаются уровни провоспалительных цитокинов, что существенно снижает эффективность иммунного ответа организма [9]. Однако в проведенном нами исследовании при генетической вариабельности полиморфизма FOK1 гена VDR не получено статистически значимых ассоциаций с вариантами микробиоты дыхательных путей у детей с БЛД.

Заключение

Таким образом, в ходе проведенного исследования доказано, что гомозиготный генотип F/F имеет предрасполагающее значение для формирования БЛД у младенцев. Гетерозиготный генотип F/f полиморфного локуса FOK1 гена VDR ассоциирован с поражениями ЦНС васкулярного характера, частыми эпизодами и ранним стартом вирусных инфекций, сопровождающимися тяжелой формой обструктивного синдрома у детей с БЛД. Полученные результаты раскрывают новые патогенетические механизмы заболевания, указывают на необходимость и перспективу персонифицированного подхода к назначению VD детям с БЛД.

Вклад авторов

Концепция и дизайн исследования – П.Б. Хиштилова, Д.Ф. Сергиенко. Сбор и обработка материала – П.Б. Хиштилова. Статистическая обработка данных – П.Б. Хиштилова. Написание текста – П.Б. Хиштилова, Д.Ф. Сергиенко. Редактирование – Д.Ф. Сергиенко.


About the Autors


Corresponding author: Diana F. Sergienko, Dr. Sci. (Med.), Professor at the Department of Faculty Pediatrics, Astrakhan State Medical University, Astrakhan, Russia, e-mail: gazken@rambler.ru
Address: 121, Bakinskaya str., Astrakhan 414000, Russian Federation


Бионика Медиа