PROGNOSTIC SIGNIFICANSE OF THE POLYMORPHISM OF GENES ASSOCIATED WITH THE RISK OF TYPE 2 DIABETES MELLITUS AND OBESITY, FOR THE DEVELOPMENT OF LIVER FIBROSIS AND HEPATIC STEATHOSIS IN PATIENTS WITH NON-ALCOHOLIC FAT LIVER DISEASE


Yu.G. Sandler (1), A.V. Polukhina (1), E.V. Vinnitskaya (1), I.G. Bakulin (2), Zh.V. Borunova (1), V.A. Keyyan (1)

1) SBHCI “Moscow Clinical Research Center n.a. A.S. Loginov” of Moscow Healthcare Department, Moscow; 2) North-Western State Medical University n.a. I.I. Mechnikov, St. Petersburg
The present study was conducted to assess the effect of polymorphism of the PPARGC1A, PPARGC1B, PPARG2 and FTO genes in patients with type 2 diabetes mellitus (DM2) on the development of liver fibrosis and hepatic steatosis. 62 DM2 patients aged from 29 to 82 years underwent complex examination. A screening assessment of hepatic steatosis and liver fibrosis in DM2 patients was performed with the use of non-invasive methods: a panel of laboratory tests (FibroTest), and liver fibroelastometry. Polymorphism of genes determining hereditary predisposition to obesity and DM2: PPARGC1A (peroxisome activator 1α receptor co-activator – Gly482Ser polymorphism (G>A), PPARGC1B (peroxisome proliferator-activated 1a receptor co-activator, Al203Pro polymorphism, G>C), PPARG2 (PPAR-gamma transcription factor, Pro12Ala polymorphism), FTO (obesity-associated gene, c.IVS1 polymorphism A>T) was evaluated. The statistical analysis was carried out using the Mann-Whitney-Wilcoxon test, Pearson’s criterion and logistic regression. As a result of examination, patients with variants of PPARGC1A, PPARGC1B, PPARG2 and FTO genes that determine an increased risk of developing DM2 and obesity were noted to have no increased risk of progression of liver fibrosis.

Введение

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) – общее понятие, включающее ряд патологических состояний, таких как стеатоз (СП), стеатогепатит (НАСГ), фиброз (ФП) и цирроз печени (ЦП), вследствие накопления липидов в клетках печени более 5% от массы печени при доказанном потреблении алкоголя менее 40 г в сутки для мужчин и 20 г для женщин [1]. НАЖБП в настоящее время – одна из наиболее актуальных проблем медицинского сообщества: распространенность НАЖБП в развитых странах достигает 30% населения. Особенно высок этот показатель в группе больных ожирением и сахарным диабетом. По данным Всемирной организации здравоохранения, среди причин смерти ожирение как фактор риска занимает 5-е место. Более 2,8 млн человек в год умирают по причинам, связанным с ожирением [2]. Точные показатели распространенности ожирения в РФ неизвестны, однако, по данным различных источников, эта цифра достигает 30% в популяции [Дедов И.И., 2006; Бокерия Л. А., 2010].

Оценка распространенности НАЖБП представляет значительные трудности, в первую очередь вследствие сложности диагностики заболевания на ранних стадиях: до сегодняшнего дня не существует специфических биохимических маркеров СП. Однако благодаря разработке и активному внедрению в клиническую практику неинвазивных методов диагностики – фиброэластометрии печени с функцией контролируемого параметра ультразвукового затухания, лабораторных тестов – получены достоверные данные о распространенности НАЖБП [3, 4].

В России эпидемиология НАЖБП изучалась в исследованиях DIREG: было показано, что частота НАЖБП в популяции достигает 37% населения и за последние годы эта цифра значительно возросла [5, 6]. Среди больных ожирением, метаболическим синдромом и сахарным диабетом 2 типа (СД2) частота НАЖБП особенно высока и варьируется в пределах от 70 до 100% [1, 7]. Масштабное исследование, посвященное распространенности НАЖБП в США, проведено в 2004 г.: были обследованы 2287 человек различного пола, возраста и этнической принадлежности. В результате было показано, что 34% обследуемых имеют НАЖБП [8]. Сходные результаты имело и другое исследование среди населения США – около 33% обследуемых страдали НАЖБП, причем были выявлены различия в зависимости от этнической принадлежности: заболевание встречалось чаще у латиноамериканцев, чуть реже – у лиц европеоидной расы и реже всего – у афроамериканцев [9].

Прогрессирование заболевания в течение длительного времени приводит к формированию фиброза и цирроза печени, хотя и не столь быстро, как при поражениях печени другой этиологии (аутоиммунный гепатит, вирусные гепатиты и т.п.) [10]. Стеатогепатит является патогенетически значимой стадией НАЖБП: при развитии воспаления прогрессирование фибротических изменений идет быстрее, нежели на стадии стеатоза: в 2004 г. представлены данные исследования, по результатам которого прогрессирование фиброза печени при неалкогольном стеатогепатите зарегистрировано в 30% случаев (морфологическое исследование печени через 4,3 года после первой биопсии) [11].

С учетом широкой распространенности НАЖБП, особенно в развитых странах, а также неуклонного роста показателей заболеваемости за последние два десятка лет проблеме НАЖБП уделяется все большее внимание. Патология печени занимает непоследнее место среди причин смертности во всем мире и составляет около 2% [12]. Как и многие другие, заболевания печени служат результатом сложного взаимодействия внешних (питание, токсические и экологические воздействия и т.п.) и генетических факторов [13]. В свете последних достижений в области генетики в рутинную клиническую практику все больше входят подходы персонализированной медицины, что позволяет не только проводить лечение уже имеющегося заболевания, но и дает возможность разработки индивидуальной профилактической и лечебной стратегии для каждого конкретного больного на основе выявления у него тех или иных факторов риска. Таким образом, геномные исследования должны обеспечить базу для развития предиктивной медицины.

Такие заболевания, как ожирение, СД2, НАЖБП, относятся к полифакторным патологиям и определяются не только внешними, но и генетическими детерминантами. Количественная оценка риска развития той или иной патологии при выявлении генетической предрасположенности сложна ввиду нелинейности реализации наследственной информации вследствие тесного взаимодействия внешних и генетических факторов [14]. Блестящей иллюстрацией значимого влияния генетических факторов в гепатологии служит определение роли области гена IL28B в оценке исходов противовирусной терапии HCV-инфекции с использованием интерферонов. Несколько исследовательских групп представили данные о том, что однонуклеотидный полиморфизм, расположенный в области гена IL28B, является предиктором эффективности интерферон-содержащей противовирусной терапии, определение которого впоследствии вошло в обязательный стандарт обследования пациентов-претендентов на противовирусную терапию и не теряло своей актуальности до наступления эры препаратов прямого противовирусного действия [15].

До этого группа ученых из США под руководством Helen Hobbs провели масштабное исследование, включившее более 6000 многонациональных представителей городского населения Далласа, с целью выявления новых факторов риска и лабораторных маркеров метаболического синдрома и сердечно-сосудистой патологии. Были исследованы 9229 однонуклеотидных полиморфизмов на предмет ассоциативной связи с наличием СД2. Было показано, что вариант rs738409 C>G, расположенный в 22-й хромосоме в пататиноподобном домене фосфолипазы 3 (PNPLA3), ассоциировался с повышенным риском развития НАЖБП, причем эта связь прослеживалась независимо от наличия ожирения, СД2, инсулинорезистентности, уровня потребления алкоголя и других факторов. Кроме того, прослеживалась связь между данным вариантом PNPLA3 и повышением уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ) у латиноамериканцев [16].

В другом масштабном исследовании SOS, опубликованном в 2012 г., показано, что в группе пациентов с ожирением, имевших вариант I148M (s738409), частота инсулинорезистентности и СД2 была выше, в то время как уровень триглицеридов в крови – ниже. Это исследование подтверждает гипотезу, будто общее ожирение и стеатоз печени имеют патогенетическую связь с СД2 [17]. Другие авторы показали, что данный вариант PNPLA3 определяет повышенную частоту не только простого стеатоза печени, но и всего спектра проявлений НАЖБП. Недавние исследования выявили еще один вариант полиморфизма PNPLA3 (rs2294918 A>G), определяющий повышенный риск развития НАЖБП [18].

Изучение взаимосвязи генетических вариантов и увеличения частоты НАЖБП проводилось с использованием различных инструментальных методик оценки стеатоза и фиброза печени: биопсия печени, МР-спектроскопия, оценка плотности печени, но не объясняло молекулярных механизмов такой взаимосвязи. Интерес представляет расшифровка патогенетических процессов при различных вариантах полиморфизма PNPLA3, что является предметом ряда исследований в настоящее время.

В 2015 г. в Великобритании были опубликованы результаты масштабного исследования WELCOME по оценке эффектов генотипов PNPLA3 и TM6SF2 (2-й член трансмембранного суперсемейства 6): 103 пациента с НАЖБП получали омега-3-полиненасыщенные жирные кислоты (докозагексаеновая и эйкозапентаеновая кислоты) и плацебо. В результате была продемонстрирована связь между наличием варианта 148M/M PNPLA3 и изменением содержания липидов в печени [19]. В том же году проведено исследование, включившее 361 человека (226 пациентов с гистологически доказанной НАЖБП и 135 – в группе контроля). Анализ показал, что вариант TM6SF2 rs58542926 ассоциировался с умеренным риском развития НАЖБП [20].

В предыдущих исследованиях уже изучалось влияние генетических полиморфизмов Gly482Ser PPARGC1A на частоту ожирения и СД2. Было показано, что риск развития данных патологий у носителей этих генетических вариантов зависит от пола и возраста. Так, в 2006 г. в журнале «Диабетология» были опубликованы результаты исследования, в котором изучалась взаимосвязь между генотипическими особенностями, возрастом, уровнем физической активности и риском ожирения. Были обследованы 899 женщин и 902 мужчины из Швеции. Установлено, что 56% мужчин и 57 % женщин имеют вариант Gly482Ser PPARGC1A. Мужчины старше 50 лет с Gly482Ser с низкой физической активностью имеют повышенный риск ожирения, в то время как старшие мужчины с высокой физической активностью, молодые мужчины, а также женщины не имели повышенного риска ожирения. Данное исследование подтверждает, что пол и возраст следует учитывать при проведении исследований влияния полиморфизма PPARGC1A Gly482Ser на обменные нарушения: риск ожирения, ассоциированный с полиморфизмом 482Ser, доказан лишь для группы мужчин старше 50 лет с низкой физической активностью [21].

В японском исследовании в 2007 г. изучалась взаимосвязь между полиморфизмом гена PPARGC1A и НАЖБП. Были обследованы 115 пациентов с морфологически верифицированной НАЖБП, 65 из которых имели стеатогепатит, 50 – стеатоз, и 441 здоровый доброволец в группе контроля. Было исследовано 15 однонуклеотидных полиморфизмов PPARGC1A, в результате чего было определено его участие в развитии НАЖБП, ожирение и СД2. Так, вариант rs2290602 значимо повышал частоту НАЖБП, причем в большей степени – на стадии стеатогепатита, и частота Т-аллели rs2290602 была достоверно выше у пациентов с НАСГ, нежели в группе контроля. Также было показано, что экспрессия PPARGC1A микро-РНК в группе ТТ была достоверно ниже, чем GG или GT однонуклеотидного полиморфизма rs2290602 [22].

PPARGC1A Gly482Ser полиморфизм также ассоциировался с ожирением, артериальной гипертонией и диабетом [23]. НАЖБП часто сопровождается ожирением, гипертриглицеридемией, СД2 и инсулинорезистентностью [24]: в моделях животных было доказано, что мыши с удаленным геном PPARGC1A чаще имели стеатоз печени [25]. Так, предполагается влияние вариантности rs2290602 гена PPARGC1A на жировой и углеводный обмен и повышение частоты развития НАЖБП [22].

Взаимосвязь варианта PPARGC1В с ожирением изучалась среди датского населения. Исследование «случай–контроль» включило 7790 пациентов, разделенных на 3 группы: с нормальным индексом массы тела, избыточным весом и ожирением. Частота Ala203Pro встречалась значимо реже в группе пациентов с ожирением. Для оценки связи варианта PPARGC1В с СД2 были обследованы 1433 пациента с диабетом и инсулинорезистентностью и 4935 – в группе контроля: в результате повышения частоты СД ни с одним из вариантов гена связано не было [26].

В исследовании, опубликованном в 2010 г. в журнале BMC Gastroenterology, исследовались эффекты однонуклеотидных полиморфизмов PPARGCА и PPARG2, ранее известных как предикторы инсулинорезистентности и дислипидемии, на прогрессирование повреждения гепатоцитов при НАЖБП. Присутствие варианта PPARGCА 162Val ассоциировалось с более высоким риском инсулинорезистентности, но не дислипидемии. Присутствие PPARGCА 162Val и PPARG2 12Ala одновременно не повышало частоты стеатоза, стеатогепатита или фиброза печени при НАЖБП [27]. Исследования влияния вариантов гена FTO показали его взаимосвязь с предрасположенностью к СД2 и ожирению [28]. Как уже было отмечено, многочисленные работы подтверждают наличие генетических детерминант, ассоциирующихся с повышенным риском ожирения и СД2. Также выявлены варианты генов, обусловливающих предрасположенность к развитию НАЖБП, однако исследований, посвященных оценке прогностического влияния данных генов на прогрессирование фиброза печени у больных СД2 и НАЖБП, найдено не было.

Материал и методы

В условиях Московского клинического научно-практического центра (ГБУЗ МКНЦ им. А.С. Логинова) комплексно обследован 81 человек в возрасте от 29 до 82 лет с диагнозом СД2. В исследование не включались больные с положительными маркерами HBsAg и/или a-HCV. В исследование включены пациенты с СД2, которым был установлен диагноз НАЖБП, – 62 человека. Диагноз установлен на основании рутинных лабораторно-инструментальных данных, оценки степени стеатоза и стадии фиброза печени с помощью неинвазивных методов: панели ФиброМакс (BioPredictive, France) и непрямой ультразвуковой фиброэластометрией (ФЭ) на аппарате FibroScan (Echosens, Франция).

У всех больных СД2 и НАЖБП был изучен полиморфизм генов, определяющих наследственную предрасположенность к ожирению и СД2: PPARGC1A (коактиватор 1альфа-рецептора активатора пероксисом – полиморфизм Gly482Ser (G>A), PPARGC1B (коактиватор 1α-рецептора, активируемого пролифераторами пероксисом типа, полиморфизм Аla203Рro, G>C), PPARG2 (фактор транскрипции PPAR гамма, полиморфизм Pro12Ala), FTO (ген, ассоциированный с жировой массой, полиморфизм c.IVS1 A>T). Материалом для исследования послужила ДНК, выделенная из цельной крови. С образцом выделенной ДНК параллельно проводились реакции амплификации с 2 парами аллель-специфичных праймеров, предназначенных для анализа олигонуклеотидного полиморфизма PPARG2 Pro12Ala, PPARGC1A, PPARGC1B и FTO (система «SNP-Экспресс – РВ» отечественного производителя ООО НПФ «Литех»). Детекция продуктов амплификации осуществлена амплификатором Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия) автоматически в каждом цикле амплификации. На основании этих данных управляющая программа строит кривые накопления флюоресцентного сигнала. Результаты анализа позволяют дать три типа заключений: гомозигота по 1 аллели, гетерозигота, гомозигота по 2 аллели.

Панель ФиброМакс включает алгоритм определенных показателей сыворотки крови (AЛT, АСТ, глюкоза, триглицериды, холестерин, общий билирубин, гаммаглутамилтранспептидаза [ГГТП], a2-макроглобулин, аполипопротеин A1, гаптоглобин, выполненных на анализаторе Olympus AU 400/Ireland с помощью реактивов Achitect 8000, Abbott/USA), а также пол, возраст, индекс массы тела. Согласно рекомендациям разработчиков панели ФиброМакс, заключение выдается по стадии фиброза (F), степени стеатоза (S), активности некровоспалительного процесса (А), определения степени стеатогепатита (N), наличия/отсутствия алкогольного стеатогепатита (H). В отношении данной когорты пациентов на аппарате FibroScan еще раз оценивалась стадия фиброза печени. У пациентов со стадией F-4 по шкале METAVIR (соответствует циррозу печени) оценивались признаки портальной гипертензии, синдрома гепатодепрессии, гиперспленизма. При этом части больных для подтверждения стадии фиброза печени выполнялась биопсия печени. Все исследования выполнялись с согласия пациентов.

Результаты исследования

Пациенты старше 50 лет составили 81%; не имевшие ожирения – 32%, лица с ожирением – 68%. Ожирение 1-й степени диагностировалось у 40% пациентов, 2-й и 3-й стадий – у 27%. Все пациенты (100%) имели стеатоз (S), при этом 11% из них имели 1-ю степень (S1), 2-ю степень (S2) – 24% пациентов, а стеатоз 3-й степени (S3) – 65%. Общая характеристика пациентов с СД2 в зависимости от пола, возраста, степени ожирения (индекс массы тела), уровня АЛТ, АСТ, ГГТП, глюкозы, холестерина, триглицеридов представлена в табл. 1.

В табл. 2–4 представлена частота встречаемости полиморфизма генов PPARGC1A, PPARGC1B, PPARG2 Pro12Ala, FTO при гомозиготном (риск высокий) и гетерозиготном носительстве (риск низкий) и без полиморфизма у пациентов с СД2 и НАЖБП со степенью стеатоза (S) и стадией фиброза (F). При этом F 0–1 расценивается как отсутствие фиброза, F 2–4 – клинически значимый фиброз, в т.ч. и отдельно F 4 – цирроз печени; S-1 – минимальная степень стеатоза, S2 – умеренная степень и S3 –высокая.

Во всех случаях с помощью непараметрических методов оценивалась взаимосвязь между полиморфизмом генов PPARGC1B, PPARG2 Pro12Ala, FTO и развитием фиброза/стеатоза печени с помощью Z-критерия, а для количественных характеристик (индекс массы тела, уровень холестерина, триглицеридов, глюкозы) критерий Манна–Уитни–Уилкоксона. Во всех случаях определялся p-value, который показывает, насколько данные согласуются с гипотезой, и если p-value <0,05, можно считать, что в группах есть разница, а значит, есть взаимосвязь. Во всех случаях статистически значимых отклонений найдено не было. Таким же образом были проанализированы показатели ИМТ, триглицеридов и холестерина. Оказалась, что для гена FTO выявлена статистическая взаимосвязь для холестерина: p-value=0,0104. Таким образом, показано, что у лиц, имеющих полиморфизм генов PPARGC1A, PPARGC1В, PPARG2 и FTO, определяющих риск развития СД2 и ожирения, риск прогрессирования фиброза и стеатоза печени не повышен по сравнению с пациентами, не имеющими таких генетических вариантов.

Обсуждение

Исследований, посвященных оценке влияния указанных генетических вариантов на прогрессирование фиброза печени при НАЖБП, ранее не проводилось. Известно, что варианты rs738409 C>G, rs2294918 A>G, расположенные в 22-й хромосоме в пататиноподобном домене фосфолипазы 3 (PNPLA3), rs2290602 гена PPARGC1A повышают риск развития у пациента НАЖБП, однако данных о темпах прогрессирования фиброза на сегодняшний день нет.

В последние годы все большее внимание уделяется изучению патогенеза НАЖБП, однако до настоящего момента единой теории не существует. Особое место занимает теория инсулинорезистентности: большинство авторов сходятся во мнении, будто имеется четкая взаимосвязь между снижением чувствительности ткани к инсулину и накоплением липидов в печени. Инсулинорезистентность способствует не только развитию жировой инфильтрации, но и усилению липогенеза в печени, что в дальнейшем инициирует процессы свободно-радикального окисления, развитие стеатогепатита и фиброза. Однако наличие стеатоза как такового не определяет прогноз болезни: именно скорость прогрессирования фибротических изменений обусловливает снижение качества жизни и исходы для пациента.

Отсутствие литературных данных о возможности такой корреляции, а также наши собственные результаты изучения генов PPARGC1A, PPARGC1В, PPARG2, FTO в группе больных СД2 и ожирением, возможно, могут свидетельствовать в пользу гипотезы, согласно которой течение НАЖБП, а также темп прогрессирования фиброза печени при данной патологии зависят в большей степени от компенсации других компонентов метаболического синдрома: достигнуты ли целевые уровни гликемии, контроль артериальной гипертонии, степень общего ожирения и т.п. Отсутствие влияния изученных генетических детерминант на прогрессирование фиброза печени не исключает наличия таковых в геноме человека и требует дальнейших исследований.

Заключение

Использование результатов исследований общегеномных ассоциаций (GWAS) для расчета риска развития заболеваний, в т.ч. для больных СД2, НАЖБП, прогрессирования фиброза печени представляется перспективным. Определение индивидуального генетического риска позволит проводить первичную профилактику заболеваний и, вероятно, будет являться основой персонализированной профилактической медицины.


About the Autors


Corresponding author: Yu.G. Sandler – SBHCI «Moscow Clinical Research Center n.a. A.S. Loginov» of Moscow Healthcare Department, Moscow; e-mail: sandlerjulia2012@gmail.com


Similar Articles


Бионика Медиа