ENDOGENOUS AMMONIA AS THE REASON OF “CIRCULUS VITIOSUS” IN PROGRESSION OF LIVER DISEASES


E.V. Golovanova

Department of Polyclinic Therapy FSBEI HE MSMSU n.a. A.I. Evdokimov of RMH, Moscow
Ammonia is one of the most important neurotoxic metabolites in the human body. In clinical practice, hepatic encephalopathy (HE) against the background of hepatopathy is the most frequent manifestation of hyperammonemia. HE represents a wide spectrum of neuropsychiatric disorders in the presence of acute or chronic hepatic-cell insufficiency and/or porto-systemic shunt. Reduction of ammonia level is a pathogenetic approach in the treatment of chronic liver diseases, which allows not only reducing the manifestations of HE, but also reducing the activation of hepatic stellate cells, improving hepatic blood flow and inhibit the development and progression of liver fibrosis.

Основным источником образования аммиака в организме человека является азот пищевого белка, образующийся в ходе реакций дезаминирования аминокислот в печени. Дополнительными источниками образования аммиака являются:

  1. Разложение мочевины и белка уреазаположительной микрофлорой желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).
  2. Образование аммиака в мышечной ткани при физической нагрузке.
  3. Распад глутамина в тонкой кишке.
  4. Абсорбция аммиака в почках при гипокалиемии и/или алкалозе.

Выделение мочевины осуществляется преимущественно через почки (около 80%), примерно 20% мочевины повторно поступают в ЖКТ, где вновь разлагается уреазаположительными бактериями до аммиака.

Детоксикация аммиака в организме осуществляется преимущественно в митохондриях перипортальных гепатоцитов за счет связывания в орнитиновом цикле с аминокислотами и образованием нетоксичной мочевины (рис. 1). Частично детоксикация аммиака происходит в мышечной ткани в процессе синтеза глутамина при участии фермента глутаминсинтетазы. Эта реакция с меньшей интенсивностью протекает также в астроцитах головного мозга и перивенозных гепатоцитах печени. Образующийся в результате этих превращений глутамин нетоксичен и выделяется с мочой.

Таким образом, являясь основным источником аммиака, печень в то же время служит главным местом его обезвреживания. Именно поэтому гипераммониемия развивается в организме человека, прежде всего при хронических заболеваниях печени (ХЗП). К причинам этого относятся снижение активности орнитинового цикла и глутаминсинтетазной реакции при печеночно-клеточной недостаточности и порто-системное шунтирование при развитии и прогрессировании портальной гипертензии.

Значительно реже в рутинной клинической практике встречаются генетически детерминированные ферментопатии, которые сопровождаются повышением концентрации аммиака в сыворотке крови. В зависимости от дефицита или дефекта того или иного фермента выделяют несколько видов генетических заболеваний: гипераммониемию типа I (в основе – дефект карбамоилфосфатсинтетазы I), гипераммониемию типа II (в основе – дефект орнитинкарбамоилтрансферазы), цитруллинемию (в основе – дефект аргининосукцинатсинтетазы), аргининосукцинатурию (в основе – дефект аргининосукцинатлиазы), гипераргининемию (в основе – дефицит аргиназы).

Известно, что аммиак является одним из важнейших нейротоксических метаболитов в организме человека. В клинической практике наиболее частым проявлением гипераммониемии является печеночная энцефалопатия (ПЭ) при патологии печени, представляющая собой спектр нервно-психических расстройств на фоне острой или хронической печеночно-клеточной недостаточности и/или портосистемном шунтировании крови. В основе патогенеза ПЭ лежит дисбаланс аминокислот в головном мозге, приводящий к отеку астроглии и нарушениям ее функций, таких как изменения постсинаптических рецепторов и процессов нейротрансмиссии, нарушение проницаемости гематоэнцефалического барьера, снижение энергетического обеспечения нейронов. Степень клинических проявлений напрямую коррелирует с уровнем аммиака в сыворотке крови. В зависимости от выраженности нарушений деятельности головного мозга выделяют четыре степени тяжести печеночной энцефалопатии (от минимальной до комы).

В последние годы в связи с совершенствованием диагностических методик актуально отделение клинически выраженных стадий ПЭ (дезориентация, атаксия, кома) от стадии с минимально выраженными проявлениями (латентная ПЭ). Такую ПЭ можно выявить, используя специальные опросники или метод вызванных потенциалов головного мозга. При этом выявляются когнитивные и психомоторные расстройства, такие как трудности с принятием решений, снижение скорости психомоторных реакций и др. К клиническим симптомам латентной ПЭ относятся повышенная утомляемость, слабость, раздражительность, инверсия сна (сонливость днем и бессонница ночью), нарушения речи, изменения почерка, рассеянность за рулем и при выполнении работы, требующей повышенной концентрации внимания, тремор, снижение мышечных рефлексов.

К сожалению, результатом таких нарушений могут стать серьезные дорожно-транспортные происшествия с тяжелыми последствиями [1, 2]. В связи с этим выявление минимальной ПЭ имеет большое значение для работников многих профессий: водителей автотранспорта, операторов на автоматизированном оборудовании и др.

В исследованиях показано, что у больных стеатозом печени при отсутствии клинических признаков воспаления и печеночно-клеточной недостаточности уже имеется выраженное снижение детоксикации аммиака по обоим путям (уменьшается синтез и мочевины, и глутамина) за счет выраженного снижения активности соответствующих ферментов в печени (рис. 2).

В 2016 г. ученые из Великобритании получили новые научные данные, свидетельствующие о том, что гипераммониемия активирует звездчатые клетки печени (ЗКП) и как следствие – может приводить к усиленному коллагенообразованию и прогрессирующему фиброзированию [3].

Известно, что ЗКП являются основными профиброгенными клетками органа. Хроническое повреждение печени под влиянием различных этиологических факторов (алкоголь, вирусная инфекция, лекарства, холестаз и др.) способствует их активации и дифференцировке в миофибробластоподобные клетки, которые приобретают сократительные, провоспалительные и фиброгенетические свойства. При этом ЗКП пролиферируют, из них исчезают капли жира, увеличивается шероховатая эндоплазматическая сеть, в них появляется специфический белок гладких мышц (α-актин), увеличивается количество рецепторов к цитокинам, стимулирующим пролиферацию и фиброгенез.

К факторам, активирующим ЗКП, относятся трансформирующий фактор роста (TGF-β1 – Transforming growth factor beta), тромбоцитарный фактор роста (PDGF – Platelet-derived growth factor), фактор роста фибробластов, интерлейкин-1 (ИЛ-1), эпидермальный фактор роста, фактор некроза опухоли α. Среди всех факторов роста TGF-β1 позиционируется как ключевой медиатор в фиброгенезе у человека. Различные способы, воздействующие на синтез этого фактора или на сигнальные пути, которые реализуются с участием этого фактора, значимо снижают фиброз в экспериментальных моделях [4].

Активированные ЗКП мигрируют и аккумулируются в месте поражения ткани печени, при этом секретируя большое количество внеклеточного матрикса и одновременно регулируя деградацию этих молекул на уровнях транскрипции и посттранскрипции. Повышение содержания информационной коллагеновой РНК является опосредующим фактором, повышающим синтез коллагена активированными ЗКП. В этих клетках посттранскрипционная регуляция коллагена осуществляется путем последовательности 3-го нетранслируемого региона РНК-связующего протеина aСР2, равно как и посредством структуры в 5-м окончании коллагена информационной РНК. Кроме этого ЗКП экспрессируют большое количество нейроэндокринных маркеров (реелин, нестин, нейротрофины, синаптофизин и глиально-фибриллярные кислотные протеины), а также несут рецепторы нейротрансмиттеров, выделяют провоспалительные цитокины, нейрофильный и моноцитарный хемоаттрактаны, которые усиливают воспалительную реакцию в пораженной печени [5].

Фиброз печени является основным, этиологически независимым путем прогрессирования хронических диффузных заболеваний печени вплоть до цирроза. Печеночный фиброз ассоциируется с изменением количества и качественного состава экстрацеллюлярного коллагенового матрикса (ЭКМ). При выраженных стадиях фиброза печень содержит приблизительно в 6 раз больше ЭКМ, чем в норме, а в его составе определяются коллагены (1-го, 3 и 4-го типов), фибронектин, ундулин, эластин, ламинин, гиалуронан и протеогликаны. Снижение скорости резорбции ЭКМ и выведение молекул металлопротеиназ являются в основном следствием перевысвобождения их специфических ингибиторов (TIMPs – tissue inhibitors of metalloproteinases). Результатом превалирования процессов образования внеклеточного матрикса над его разрушением является формирование фиброзного рубца, при этом фиброз на ранних стадиях развития – процесс обратимый, а цирроз с характерными сшивками между коллагеновыми волокнами и узлами регенерации необратим. Прогрессирующее накопление и отложение внеклеточного матрикса в пространстве Диссе приводят к исчезновению фенестров эндотелия, капилляризации и стенозированию синусоидов с постепенным развитием портальной гипертензии [6–8].

Таким образом, в прогрессировании ХЗП главенствующую роль играют повреждения и ишемия гепатоцитов, которые запускают регенераторные процессы воспаления и коллагенообразования. В свою очередь повышенное коллагенообразование из-за избыточного отложения внеклеточного матрикса и нарушения портального кровотока также приводит к ишемии и некрозу гепатоцитов. Таким образом, можно говорить о «circulus vitiosus» (порочном круге) в прогрессировании заболеваний печени.

Почему ученые из Великобритании считают, что гипераммониемия способна выступить важным фактором в этом «circulus vitiosus»? Такие выводы были сделаны на основе результатов собственного исследования, состоявшего из двух частей: in vitro и in vivo. Первичные ЗКП, полученные из печени здоровых доноров (hHSCs – human hematopoietic stem cells), были посеяны (плотность – 26×103/см2) в исходных, богатых сывороткой условиях (CM – полная среда) на 24 часа с последующим удалением сыворотки на следующие 24 часа (SFM – Serum-free medium). Экзогенный глутамин был удален из культуральной среды во избежание искажения результатов эксперимента.

In vitro показано, что аммиак дозозависимо снижает клеточную пролиферацию и метаболизм в первичных человеческих ЗКП, но не вызывает гибели клеток.

Длительная обработка клеток аммиаком (до 72 часов) индуцирует развитие и прогрессирование эндоретикулярного стресса в hHSCs, что проявлялось выраженным перинуклеарным накоплением красителя (ER-Tracker™ Red) и появлением цитоплазматических вакуолей по мере роста концентрации аммиака. Использование Image IT™-набора для определения зеленых активных форм кислорода позволило исследователям выявить аммиак-дозозависимое образование активных радикалов кислорода (ROS – Reactive oxygen species) в hHSCs. Таким образом, установлено, что увеличение концентрации аммиака и время его воздействия напрямую влияют на уровни мРНК экспрессии маркеров стресса [3].

Исследование также показало, что при повышенных концентрациях аммиака hHSCs приобретают выраженный профиброгенный и провоспалительный потенциал, что подтверждается результатами исследования in vitro:

  • аммиак значительно увеличивает экспрессию белка α-SMA, являющегося активатором ЗКП, а при уровне аммиака 300 мкМ увеличивается синтез виментина – важного промежуточного филамента;
  • возрастание концентраций аммиака сопровождается увеличением уровней миозина IIa (играющего ключевую роль в сокращении HSC), миозина IIb (важный фактор активации HSC); экспрессией p38 MAPK, ростом уровней PDGF-Rβ и коллагена I типа;
  • повышение уровней аммиака индуцирует сильный и значимый рост мРНК экспрессии металлопротеиназ-2, в то время как мРНК-экспрессия TIMP1 снижается;
  • при обработке hHSC аммиаком в концентрации 300 мкМ на протяжении 72 часов мРНК значительно возрастает экспрессия провоспалительного ИЛ-1β;
  • аммиак в дозах 50 и 100 мкМ значительно увеличивает в hHSC мРНК- экспрессию ИЛ-6, но не изменяет мРНК-экспрессию ИЛ-8.

При гистологическом изучении клеток установлено, что аммиак дозозависимо вызывает серьезные морфологические изменения. Так, при световой микроскопии и в тесте жизнеспособности с нейтральным красным (20х, 40х) наблюдали превращение миофибробластоподобных клеток в веретеноподобные фибробласты под действием повышенных концентраций аммиака (рис. 3). Электронная микроскопия показала изменения структуры цитоскелета клеток с образованием цитоплазматических вакуолей при гипераммониемии, однако эти изменения быстро регрессировали после помещения клеток в безаммиачную среду [3].

Вторая часть исследования была проведена на самцах крыс, которые были разделены на три группы: в двух группах проведено перевязывание общего желчного протока (BDL – экспериментальная модель холестаза) с целью формирования экспериментального повреждения печени, при этом крысам одной из групп вводился орнитин (ОР), второй – физиологический раствор. Третья группа животных была контрольной, без повреждения печени.

Анализ результатов опыта показал, что концентрации аммиака были значительно увеличены в плазме крыс с BDL по сравнению с контролем (182±12,8 против 62,51±6,2 мкМ; p<0,0001), при лечении OP уровни аммиака значительно снижались (83,8±16,3 мкМ; p<0,0001). Изменения уровней аммиака в плазме прямо коррелировали с изменениями портального давления, которое было значительно выше у крыс с BDL по сравнению с крысами контроля (14±0,6 против 5,5±0,3 мм рт.ст.; p<0,0001). Снижение уровня аммиака на фоне лечения OP сопровождалось значительным снижением портального давления по сравнению с крысами с BDL, получавшими физиологический раствор (11,3±0,3 мм рт.ст.; p<0,01).

Дополнительным фактором риска портальной гипертензии при гипераммониемии является нитрозативный стресс, являющийся причиной нарушений печеночной гемодинамики. Так, у крыс с BDL наблюдали статистически значимое по сравнению с контрольной группой (p<0,001) увеличение белковой экспрессии показателей возросшего нитрозативного стресса: индуцированной NO синтазы (iNOS), эндотелиальной NO синтазы (eNOS), кавеолина-1 (внутриклеточного ингибитора eNOS) и 3-N тирозина. Прием OP значительно (p<0,01) снижал экспрессию iNOS, кавеолина-1 и 3-N тирозина (В и С). Сниженная ферментативная активность eNOS у крыс с BDL, усилившая нитрозативный стресс, также была восстановлена после лечения OP до практически нормальных уровней (p<0,01).

Таким образом, in vitro и in vivo исследовано многообразие влияний аммиака на функциональную активность печени [3]. Показано, что гипераммониемия является причиной следующих нарушений:

  • активации ЗКП,
  • снижения клеточного метаболизма и пролиферации ЗКП,
  • активации профиброгенного/провоспалительного профиля ЗКП,
  • нарушения внутрипеченочной гемодинамики и нарастания портального давления,
  • стимуляции эндоретикулярного стресса,
  • индукции образования активных форм кислорода.

Таким образом, в список факторов, активирующих ЗКП и имеющих большое значение в прогрессировании ХЗП, необходимо внести гипераммониемию. В связи с этим с целью снижения уровней аммиака чрезвычайно актуальным представляется применение L-орнитин-L-аспартата (LOLA, Гепа-Мерц), препарата, обеспечивающего обезвреживание аммиака в клетках печени, мышцах и астроцитах головного мозга. Важной особенностью L-орнитин-L-аспартата является непосредственное участие препарата в орнитиновом цикле обезвреживания аммиака.

В многочисленных исследованиях доказана гипоаммониемическая эффективность LOLA, позволяющая достоверно снижать проявления ПЭ. Так, лечение минимальной ПЭ у больных циррозом печени сопровождается достоверным снижением уровней аммиака в сыворотке крови, коррелирующим со снижением выраженности ПЭ, снижением частоты нарушений Правил дорожного движения с 0,82 до 0,51 и снижением частоты дорожно-транспортных происшествий с 0,18 до 0,0039 [1].

Гепатопротективные свойства LOLA показаны в отношении пациентов с ХЗП различной этиологии [9,10,11]. Данные многоцентрового нерандомизированного проспективного когортного исследования, проведенного в Германии, с участием 1167 пациентов с ХЗП, в т.ч. 648 больных неалкогольным стеатогепатитом, продемонстрировали эффективность и хорошую переносимость LOLA [12].

Нарастание концентрации аммиака выявляется у больных ХЗП уже на доцирротической стадии [9]. В исследовании с участием больных неалкогольной жировой болезнью печени показано, что на фоне применения L-орнитин-L-аспартата гипераммониемия, исходно имевшаяся на 0–1-й стадии фиброза, существенно снизилась, что сопровождалось улучшением общего состояния и лабораторных показателей. В другом российском исследовании с использованием реогепатографии было убедительно показано нарушение портального кровотока при гипераммониемии у пациентов с доцирротическими стадиями ХЗП [13]. Лечение 289 пациентов с неалкогольным стеатогепатитом с использованием LOLA на протяжении трех месяцев на фоне хорошей переносимости и высокой приверженности больных способствовало снижению уровней аммиака, коррелирующему с уменьшением сосудистых нарушений, статистически значимому улучшению клинико-биохимических показателей и качества жизни [14].

В декабре 2015 г. МЗ РФ в инструкцию препарата L-орнитин-L-аспартат были внесены важные изменения. Теперь показаниями к применению L-орнитин-L-аспартат кроме ХЗП, сопровождающихся ПЭ, являются стеатозы и стеатогепатиты различного генеза. В ноябре 2016 г. L-орнитин-L-аспартат внесен в рекомендации Научного общества гастроэнтерологов России и Российского научного медицинского общества терапевтов по диагностике и лечению неалкогольной жировой болезни печени (2-я версия).

Таким образом, снижение уровня аммиака является патогенетическим подходом к лечению ХЗП, позволяющим не только снижать проявления ПЭ, но и уменьшать активацию ЗКП, улучшать печеночный кровоток и препятствовать развитию и прогрессированию фиброза печени.


About the Autors


Corresponding author: E.V. Golovanova – MD, Prof. at the Department of Polyclinic Therapy FSBEI HE MSMSU n.a. A.I. Evdokimov of RMH, Moscow; e-mail: golovanovaev@mail.ru


Similar Articles


Бионика Медиа