LIPID PEROXIDATION AND ACTIVITY OF LIPOPROTEIN-ASSOCIATED PHOSPHOLIPASE A2 IN THE SERUM IN PATIENTS WITH NONALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE


L.A. Zvenigorodskaya, M.V. Shinkin, T.V. Nilova, A.V. Petrakov, A.E. Lychkova

SBHCI "Moscow Clinical Research and Practical Center" of the Moscow Healthcare Department
The article presents the results of evaluation of the malondialdehyde (MDA) levels in 80 patients with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), the relationship of peroxidation and phospholipase mechanisms of hepatocyte membrane damage with other markers of inflammation. Basic morphological changes in examined patents were characterized by macrovesicular hepatic steatosis. The analysis of biochemical parameters showed 2-3-fold increase of aminotransferase and gamma-glutamyl levels in 40% of cases. Lipid spectrum in examined patients was characterized by an increase in total cholesterol, LDL, triglycerides and decrease in high-density lipoprotein levels. Relationship between inflammatory markers (lipoprotein-associated phospholipase A2 - LpPLA2, nitric oxide - NO, endotoxin - ET, MDA), morphological pattern of the hepatic injury and activity of liver enzymes was revealed. LpPLA2 activity in 40% of NAFLD patients was increased by 3.8 times compared with that of in the control group and in patients with steatosis, and it was accompanied by an increase in liver enzyme activity and severity of morphological changes. NAFLD leads to the development of antioxidant system failure as a result of the activation of lipid peroxidation. In patients with NAFLD, serum MDA levels were 2-fold increased, in patients with steatohepatitis – in 30% of cases. LpPLA2 activity and MDA levels had correlation (r = -578). Increase in ET, NO levels and LpPLA2 activity were observed with the progression of inflammatory liver infiltration.

Внастоящее время неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) считается одним из основных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний. Печень играет важную роль в развитии атерогенной дислипидемии [1, 2, 4]. При прогрессировании ожирения увеличивается поступление в печень свободных жирных кислот [3, 4, 9, 13], в результате происходит усиление процессов перекисного окисления липидов – ПОЛ [2, 5–7, 15, 17]. Воздействие токсических форм кислорода на ненасыщенные жирные кислоты (фосфолипидов, триглицеридов, эфиров холестерина) ведет к их разрушению и появлению таких токсичных альдегидов, как малоновый диальдегид (МДА). Накопление перекисей липидов в тканях сопровождается разрушением молекулярной структуры мембран. Фосфолипиды являются важнейшими компонентами клеточных мембран и пред-ставлены в основном фосфатидилхолинами. Фосфолипидный состав определяет жидкокристаллические свойства и проницаемость мембран [8, 16]. Мембраны обеспечивают нормальную работу белков-транспортеров, ферментов, катализирующих процессы окисления, клеточного дыхания, окислительного фосфорилирования. При НАЖБП наблюдается снижение содержания фосфатидилхолина в гепатоцитах [9 14]. Фосфатидилхолин синтезируется в гепатоцитах при достаточном уровне холина. Интенсификация процессов ПОЛ зависит от степени повреждения мембран гепатоцитов. Накопление ПОЛ в гепатоцитах играет большую роль в нарушении их ультраструктуры. Перекисный и фосфолипазный механизмы повреждения липидов тесно связаны. Липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2 (ФЛА2) связана в плазме с атерогенными частицами липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), является высокоспецифичным маркером васкулярного воспаления [6, 7, 10]. Повышенный уровень ФЛА2 в сыворотке крови указывает на наличие бляшки, склонной к разрыву, и является независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, в т.ч. коронарного атеросклероза, инфаркта миокарда и инсульта [11, 12, 18].

Свободнорадикальные реакции ПОЛ протекают во всех клетках и тканях живых организмов, в основном в биомембранах, и представляют собой каскад окислительных реакций деградации ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов.

В клетках здорового организма уровень ПОЛ является жизненно важным звеном в регуляции проницаемости и транспорта веществ через мембраны, в синтезе простагландинов, метаболизме стероидных гормонов и других клеточных механизмах [15]. Окислительные реакции с участием свободных радикалов рассматриваются в настоящее время как необ-ходимый процесс в регуляции клеточного метаболизма. Особо большое значение ПОЛ для организма заключается в обновлении мембран клеток. При нарушении структуры и функции клеточной мембраны изменяется концентрация ионов по обе стороны мембраны, повреждаются функции сигнальных и транспортных систем. Это приводит к развитию инсулинорезистентности. Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) являются субстратом для синтеза простагландинов. Избыток кальция активирует фосфолипазу А2, что отражается на структуре фосфолипидов, в митохондриях уменьшается содержание фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина.

При активации фосфолипаз из фосфолипидов высвобождаются ПНЖК и легко окисляются. Окисление ПНЖК с образованием эндоперекисей может происходить в процессе ПОЛ, необходимом для синтеза лейкотриенов, регуляции липидного состава мембран, метаболизма катехоламинов и фагоцитоза. Стационарный уровень протекания ПОЛ регулируется антиоксидантной системой, которая ограничивает образование липидных радикалов. Супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионзависимые ферменты сохраняют клетки от окислительного стресса. Активность ферментов антиоксидантной защиты снижается при воспалении, а активация фосфолипазы увеличивается [5, 16]. Ингибировать глутатионзависимые ферменты могут продукты фосфолипазного гидролиза – свободные жирные кислоты. Важную роль в антиоксидантной защите организма играют пептиды, в состав которых входят SH-содержащие аминокислоты: цистеин, цистин и метионин. Особое место занимает глутатион, образованный аминокислотами цистеином, глицином и глутаминовой кислотой. SH-содержащие соединения защищают клетки от повреждающего действия свободных радикалов. Дефицит холина и метионина способствует угнетению фермента стеаторил-коэнзим А-десатураза-1 (SCD-1), который катализирует десатурацию пальмитиновой и стеариновой кислот, регулирует запасы триглицеридов в клетке и проявляет защитное действие на клетки печени. Низкая активность SCD-1 усугубляет тяжесть течения стеатогепатита [17].

При стеатогепатите морфологические изменения характеризуются формированием гигантских митохондрий, что ведет к апоптозу клеток. Воспалительная реакция представ-лена внутридольковыми инфильтратами на фоне жировой дистрофии гепатоцитов. Также наблюдаются жировые кисты, «пустые» ядра гепатоцитов, липогранулемы [5].

Воспалительная реакция начинается с эндотелия. При воспалении, гипоксии, эндотоксиновой агрессии происходит нарушение функции эндотелия. Макрофаги под действием эндотоксина (Эт) выделяют NO, который легко проникает в клетки и взаимодействует с ферментами и белками. NO ингибирует калий-натрий-АТФазу, тем самым снижается чувствительность к инсулину, ингибируются митохондриальные ферменты, цитохром-Р450, который метаболизирует жирные кислоты и холестерин; происходит накопление свободных жирных кислот в клетках печени.

В условиях гипергликемии усиливаются процессы ПОЛ, что может индуцировать апоптоз за счет активации ядерного фактора транскрипции, повышающего экспрессию индуцибельной синтазы NO. Влияние липополисахаридов и других медиаторов воспаления на функцию печени вызывает экспрессию синтеза фосфолипазы А2 и усиление жировой инфильтрации печени. Усиление гепатоцитами и клетками эндотелия синтеза ФЛА2 формирует воспалительный процесс.

ФЛА2 гидролизует фосфолипиды в ЛПВП и ЛПНП в кровотоке. В результате гидролиза образуется лизофосфатидилхолин (лизо-ФХ) – активный провоспалительный липид, который стимулирует образование активных форм кислорода нейтрофилами, клетками эндотелия и макрофагами в интиме артерий. Лизо-ФХ также изменяет активность синтазы NO и количество синтезируемого NO.

Лизо-ФХ играет ключевую роль в атерогенезе, являясь цитотоксичным к клеткам сосудов, резко изменяет текучесть мембран, способствует высвобождению медиаторов воспаления, также изменяет активность синтазы NO и количество синтезируемого NO.

Происходит нарушение эндотелийзависимой вазодилатации за счет снижения биодоступности NO для гладкомышечных клеток артериол [14]. Липолитический фермент ФЛА2 проявляет свою активность в клетках печени. Особое значение имеет фосфолипазная активность митохондрий, которая играет ведущую роль в развитии некротических изменений в клетке.

Цель настоящего исследования – определить уровень МДА у больных НАЖБП в сыворотке крови и его связь с повреждением мембран гепатоцитов в зависимости от морфологической картины заболевания. Выявить взаимосвязь перекисного и фосфолипазного механизмов повреждения мембран гепатоцитов с другими маркерами воспаления, Эт и оксидом азота (NO).

Материал и методы

Обследованы 80 больных НАЖБП (59 женщин и 21 мужчина). Средний возраст составил 53,5±9,5 года. Индекс массы тела (ИМТ) – более 30 кг/м2. Диагноз был верифицирован с помощью клинических, биохимических, инструментальных и морфологических методов исследования. Основные морфологические изменения у обследованных больных характеризовались крупнокапельной жировой дистрофией гепатоцитов (рис. 4–6). При анализе биохимических показателей в 40% случаев отмечено повышение уровней аминотрансфераз и γ-глутамилтранспептидазы в 2–3 раза. Показатели липидного спектра обсле-дуемых больных характеризовались повышением уровней общего холестерина, ЛПНП, триглицеридов и снижением уровня липопротеидов высокой плотности (ЛПВП).

Содержание ФЛА2 определяли иммуноферментным методом с помощью диагностических наборов PLAC TEST Elisa Kit (CША). Метод позволяет проводить измерение содержания белка секретируемой ФЛА2 при использовании высокоспецифичных моноклональных антител. ПОЛ определяли по содержанию МДА с тиобарбитуровой кислотой [13]. Для определения Эт применяли хромогенный метод по конечной точке с использованием ЛАЛ-теста (Limulus amebocyte lysate, США). Уровень метаболитов NO определяли скрининг-методом в биологических жидкостях как маркер дисфункции эндотелия с хлоридом ванадия (Германия) [11, 14]. Статистическую обработку данных провели с использованием программ «Биостат» и «Статистика».

Результаты исследования и их обсуждение

Верхней границей физиологического уровня принято считать 200 нг/мл. У 33 (40%) больных НАЖБП в стадии стеатогепатита (НАСГ – неалкогольный стеатогепатит) содержание ФЛА2 было повышено в 3,8 раза (медиана – 199,7–528,2 нг/мл) и составило 493,6±81,93 нг/мл, из них у 22 больных с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений (медиана – 324,3–764,4) составило в среднем 488,9±25,86 нг/мл (рис. 1а).

При попадании в кровоток ФЛА2 связывается и транспортируется с ЛПНП, отмечена тесная корреляционная связь ФЛА2 с ЛПНП (r=0,957; р<0,001; рис. 1б). Ниже физиологического уровня было отмечено содержание ФЛА2 у 47 (60%) больных, в среднем 129,7±6,22 нг/мл. Активность фермента в плазме и тканях регулируется индукцией цитокинов и бактериальных токсинов и коррелирует со степенью развития патологических процессов при различных заболеваниях.

У 65 больных НАЖБП в стадии НАСГ в сыворотке крови было определено содержание МДА и ФЛА2. Содержание МДА у этих больных было увеличено в 2 раза и составило в среднем 18,81±1,24, в контроле – 9,94±1,62 мкмоль/л (рис. 2а).

Отмечен высокий уровень ФЛА2 (640 нг/мл) и МДА (15,98 мкмоль/л) у 26 больных НАСГ (рис. 3а, 3б) и низкий уровень ФЛА2 при нормальном содержании МДА у остальных больных (рис. 3в). НАЖБП и МДА находились в отрицательной корреляционной зависимости, коэффициент – 0,578 (рис. 2б).

При чрезмерном накоплении липидов в гепатоцитах усиливаются процессы ПОЛ, что ведет к некрозу гепатоцитов, нарушению функций митохондрий, постепенному развитию фиброза печени и формированию стеатогепатита.

Сравнительный анализ содержания стабильных метаболитов NO в сыворотке крови больных пациентов контрольной группы показал, что воспалительный процесс в группе стеатогепатита достоверно сопровождался повышенной продукцией NO. Уровень метаболитов возрастал параллельно концентрации аминотрансфераз. Отмечена корреляционная зависимость между NO и аланиаминотрансаминазой (АЛТ) (r=0,86; р=0,001). Уровень ФЛА2 возрастал при воспалении у больных НАСГ и коррелировал с уровнем NO (r=0,62; р=0,001).

У пациентов с висцеральным ожирением и инсулинорезистентностью усиление оксидативного стресса приводит к инактивации NO за счет накопления реактивных кислородных радикалов. Нарушается равновесие в системе NO в сторону увеличения концентрации сосудосуживающих факторов и снижения биодоступности NO. Повреждение эндотелия сосудов усугубляется воздействием окисленных форм ЛПНП.

Содержание Эт в сыворотке крови было повышено у больных НАСГ по сравнению с контролем и больными стеатозом печени. При попадании липополисахаридов в системный кровоток он связывается с белком и запускает каскад иммунных реакций. Эндотоксемия определяется как циркуляция в крови бактериальных Эт в концентрации выше 2,5 ЕЭ [8, 9]. Отмечена корреляционная связь между содержанием Эт и NO (r=0,62; р=0,001). Повышение уровней Эт и NO выявлено при прогрессировании воспалительной инфильтрации в печени, что доказывает участие маркеров воспаления в патогенезе НАЖБП.

При НАЖБП содержание маркеров воспаления было повышено при воспалительной стадии перехода стеатоза к стеатогепатиту параллельно повышению уровней печеночных ферментов и морфологической картине воспалительной инфильтрации в печени.

В настоящее время для больных НАЖБП используют препараты, сочетающие антиоксидантную защиту, стабилизацию мембран гепатоцитов, противовоспалительную терапию [8].

1. Гепатопротекторы (эссенциальные фосфолипиды, урсодезоксихолевая кислота, препараты липоевой кислоты, орнитин, таурин).

2. Антиоксиданты (витамин+ретинол, омега-3 триглицериды, Липостабил и др.).

3. Антибактериальные препараты (санация толстой кишки рифаксимин, метронидазол, макролиды и др.).

4. Пре- и пробиотики (Бифи-думбактерин, Лактумбактерин, Споробактерин бифиформкомплекс).

Результатом восстановления энтерогепатической циркуляции желчных кислот является нормализация процессов синтеза желчи в печени и адекватного поступления ее в кишечник [24].

Выводы

Выявлена связь между маркерами воспаления (ФЛА2, NO, Эт, МДА), морфологической картиной печени и активностью печеночных ферментов. Активность ФЛА2 при НАСГ у 40% больных была увеличена в 3,8 раза по сравнению с таковой в контрольной группе и у больных стеатозом, что сопровождалось повышением активности печеночных ферментов и тяжестью морфологических изменений.

При НАЖБП развивается недостаточность антиоксидантной системы в результате активации процессов ПОЛ. Содержание МДА в сыворотке крови было увеличено в 2 раза у больных НАЖБП при стеатогепатите в 30% случаев. Активность ФЛА2 и уровень МДА находились в корреляционной зависимости (r=-578).

Повышение уровней Эт, NO и активность ФЛА2 отмечались при прогрессировании воспалительной инфильтрации в печени.


About the Autors


L.A. Zvenigorodskaya – Doctor of Medical Sciences, Professor, Leading Researcher of the Endocrinological Service SBHCI "Moscow Clinical Research and Practical Center" of the Moscow Healthcare Department


Similar Articles


Бионика Медиа