Предотвращение ранних и поздних потерь беременности в сложившихся условиях отрицательного естественного прироста населения в Российской Федерации (Росстат, 2021) считается одной из важнейших задач современного акушерства и гинекологии.
Известно, что в мире ежегодно регистрируется 23 млн случаев самопроизвольных выкидышей, совокупный риск которых составляет 15,3% всех диагностированных беременностей [1]. Ранние репродуктивные потери в зависимости от этиологических факторов можно условно разделить на предотвратимые и непредотвратимые. Причиной почти 50% спорадических выкидышей являются «немодифицируемые» хромосомные дефекты, коррекция которых при нормальном кариотипе родителей на данном этапе развития науки и практической медицины пока не представляется возможной [2]. В этой связи основные усилия врача-клинициста должны быть направлены на устранение так называемых «управляемых» факторов ранних потерь беременности, к которым относят поведенческие, анатомические, эндокринные, токсические, иммунологические, а также инфекционные [3–6]. До начала пандемии COVID-19 было установлено, что инфекционными причинами, включающими весь спектр вирусных, бактериальных и протозойных заболеваний человека, объясняется до 15% случаев потерь беременности до 20 недель [7]. Однако изолированное влияние аномального состава цервико-вагинального микробиома на ранние сроки остается окончательно не выясненным [8]. Кроме того, крайне мало работ, описывающих последствия влияния нарушений микробного равновесия цервико-вагинального локуса до 12 недель беременности на частоту преждевременных родов. Немногочисленные исследования демонстрируют, что на начальных сроках гестации манифестация острых и усиление хронических инфекций могут нарушать тонкие иммунозависимые механизмы, связанные с имплантацией плодного яйца, цитотрофобластической инвазией, ремоделированием спиральных артерий, плацентацией, что в итоге клинически выражается самопроизвольным выкидышем или развитием «больших акушерских синдромов» [9, 10]. По данным ВОЗ, частота преждевременных родов в мире колеблется от 5 до 18% от общего количества рожденных в зависимости от популяции, что приводит к ежегодному появлению 15 млн недоношенных детей [11]. В среднем 40–50% спонтанных преждевременных родов, чаще всего происходящих между 22 и 32 неделями беременности, связываются с прямым воздействием различных инфекционных возбудителей [12].
В настоящее время научный прогресс в области молекулярной биологии и генетики существенно расширяет возможности изучения влагалищного микробиома как «полноценного участника» гестационного процесса, что, вероятно, в перспективе позволит практическому врачу через оценку параметров цервико-вагинального микробного сообщества в ранние сроки получить эффективный инструмент для прогнозирования, а в последующем – и для предотвращения акушерских осложнений.
Исходя из вышеизложенного, целью нашего исследования явилась оценка характера течения и исходов гестации в зависимости от количественного и качественного состава цервико-вагинального микробиома в ранние сроки беременности.
Материалы и методы
Для достижения поставленной цели провели лабораторное обследование 153 женщин репродуктивного возраста, подписавших добровольное информированное согласие на участие в исследовании согласно приказу Министерства здравоохранения РФ от 20 октября 2020 г. N 1130н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи пo профилю “акушерство и гинекология”». Все беременные были разделены на группы: основную группу составили 73 пациентки, госпитализированные в гинекологическое отделение ГКБ № 1 им. Н.И. Пирогова и ГКБ № 36 им. Ф.И. Иноземцева г. Москвы с верифицированным диагнозом угрожающего выкидыша в I триместре.
Набор пациенток в основную группу осуществлялся согласно критериям включения: возраст пациенток в диапазоне 18–35 лет; одноплодная маточная беременность; срок гестации 7–12 недель; диагноз «угрожающий выкидыш», верифицированный на основании кровяных выделений из половых путей. Критериями исключения стали: беременность, наступившая с использованием вспомогательных репродуктивных технологий; тяжелые экстрагенитальные заболевания; ВИЧ-инфекция, сифилис, инфекционные гепатиты (В и С); прием противомикробных препаратов в течение предшествующих 4 недель до момента включения в протокол; наличие других факторов, приводящих к угрозе прерывания беременности: привычное невынашивание, прием наркотических и психоактивных веществ, злоупотребление алкоголем.
Контрольную группу сформировали 80 женщин с физиологическим течением беременности при постановке на учет в момент обращения к акушеру-гинекологу. Забор биологического материала проводили в амбулаторных условиях.
Исследуемые группы были сопоставимы: медианы возраста пациенток основной и контрольной групп составляли 30 и 29 лет соответственно (р>0,05). Изучаемые выборки не различались по паритету: процент повторных беременностей в основной и контрольной группах составил 42,7 и 41% соответственно (р>0,05). В гинекологическом анамнезе не было выявлено статистически значимых различий: средний возраст менархе составил 13 лет (p>0,05), регулярный ритм менструаций наблюдался в основной группе у 85,3% женщин, в контрольной – у 75,6%, (р>0,05).
Всем пациенткам была проведена диагностика с применением стандартных методик, регламентированных существующими нормативно-правовыми документами, включающая общеклинические лабораторные и функциональные методы исследования, а также специальные методы.
Для оценки влияния состояния цервико-вагинального микробиома в I триместре на исход гестации включенные в исследование женщины были ретроспективно разделены на 3 группы: I группу сформировали 122 пациентки со срочными родами, II группу – 7 женщин с преждевременными родами, III группу – 24 пациентки с самопроизвольным выкидышем (рис. 1).
Выявление основных возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (хламидийная, гонококковая инфекции, трихомониаз, M. genitalium-инфекции); диагностику инфекционных заболеваний, сопровождающихся нарушением баланса вагинального микробиома – бактериального вагиноза (БВ), аэробного вагинита (АВ), кандидозного вульвовагинита (КВВ); выявление условно-патогенных генитальных микоплазм (УПГМ) проводили с использованием тестов АмплиПрайм-NCMT и ФЛОРОСКРИН (АмплиПрайм-ФЛОРОСКРИН-Бактериальный вагиноз (АмплиПрайм-ФЛОРОСКРИН-Аэробы, АмплиПрайм-ФЛОРОСКРИН-Кандиды, АмлиПрайм-ФЛОРОСКРИН-Микоплазмы) производства ООО «НекстБио» (Москва, Россия)) на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с количественной оценкой концентрации ДНК микроорганизмов-маркеров соответствующих инфекций в образцах биологического материала, полученных путем забора цервико-вагинального отделяемого одноразовыми зондами-тампонами в транспортную среду («ТСМ»). С помощью программного обеспечения «FRT-manager» (ООО «Интерлабсервис») производился автоматический расчет концентраций (в геномных эквивалентах на 1 мл, ГЭ/мл) и соотношения ДНК микроорганизмов-маркеров с выдачей лабораторного заключения, на основании которого с учетом клинических данных пациенток устанавливался диагноз.
Диагнозы «хламидийная инфекция», «гонококковая инфекция», «трихомониаз», «инфекция, вызванная M. genitalium (MG-инфекция)» устанавливали на основании обнаружения ДНК микроорганизмов: Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium соответственно с использованием набора реагентов АмплиПрайм-NCMT. Диагностика БВ проводилась путем оценки разницы логарифмов концентраций ДНК лактобациллярной флоры, общего количества ДНК бактерий и ДНК Gardnerella vaginalis (s.l.) и Atopobium vaginae (нов. Fannyhessea vaginae). Лабораторное заключение с формулировкой «Соотношения концентраций ДНК микроорганизмов соответствуют бактериальному вагинозу» являлось основанием для постановки диагноза БВ. Клиническое значение УПГМ – Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum учитывалось при концентрации какой-либо из них более 105 ГЭ/мл и наличия у пациентки БВ.
Диагноз АВ верифицировали на основании наличия клинической картины вагинита с обнаружением ДНК факультативно-анаэробных микроорганизмов: Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp. в концентрациях, превышающих ДНК лактобацилл (лабораторное заключение теста ФЛОРОСКРИН с формулировкой «Преобладают аэробные бактерии»).
Диагноз КВВ устанавливали на основании наличия характерной клинической картины вагинита и выявлении ДНК видов грибов рода Candida (C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis/tropicalis) в концентрации выше 102 ГЭ/мл.
Диагноз «микст-инфекции» устанавливался на основании выявления одновременного сочетания двух и более инфекционных нозологий/синдромов.
Статистический анализ
Данные обрабатывали с использованием программных средств Statistica 8.0 и MS Office Excel 2010. Оценку характера распределения проводили по критериям Шапиро–Уилка и Колмогорова–Смирнова. Учитывая отклонение от нормальности распределения, применяли непараметрические методы с расчетом медианы (Me) и интерквартильного размаха [Q1–Q3], а также U-критерий Манна–Уитни. Для количественных признаков применяли непараметрический дисперсионный анализ, а также критерий Краскела–Уоллиса. Кратность риска исхода беременности в зависимости от клинического диагноза определяли по формуле относительного риска, как отношение доли фактора влияния в исследуемой группе к доле фактора влияния в группе срочные роды. Различия между номинативными, категориальными переменными и частотами встречаемости оценивали через критерий χ2 или точный критерий Фишера. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты
У 24/73 пациенток основной группы (32,9%) беременность завершилась ранним спонтанным выкидышем, у 4/73 (5,5%) – преждевременными родами (до 37 акушерских недель), а у 45/73 (61,6%) – срочными родами. Среди пациенток контрольной группы исходы гестации распределились следующим образом: 77/80 (96,3%) женщин родили в срок; у 3/80 (3,7%) беременность завершилась преждевременными родами; случаев ранних потерь беременности зарегистрировано не было (табл. 1).
Для оценки влияния состояния цервико-вагинального микробиома в I триместре на исходы гестации все пациентки, включенные в исследование (вне зависимости от характера течения ранних сроков), были ретроспективно разделены на 3 группы: I группу сформировали женщины, беременность которых завершилась срочными родами (n=122), II группу – преждевременными родами (n=7), III группу – самопроизвольным выкидышем (n=24).
Среди пациенток общей выборки было зафиксировано два эпизода выявления инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), в рамках микст-инфекций: случай хламидийной инфекции в сочетании с БВ и АВ; при этом беременность у пациентки прервалась в 12 недель гестации; и инфекция, вызванная M. genitalium в сочетании с БВ и КВВ, – завершилась выкидышем в 14 акушерских недель.
Анализ данных (рис. 2) выявил значительное увеличение частоты БВ (до 70,8%) среди женщин, беременность которых прервалась в первой половине, по сравнению с группами срочных (22,2%, p<0,05) и преждевременных родов (28,6%, p<0,05), что указывает на значимость данного синдрома как фактора риска осложнений беременности. Риски инфекционно-индуцированного спонтанного выкидыша увеличиваются в 6 раз при наличии БВ у беременных в I триместре (ОР=5,7; p<0,01). АВ был зарегистрирован в 8,3% случаев при спонтанном выкидыше, что вдвое превышает частоту его обнаружения среди пациенток I группы (3,9%, p<0,05). В группе преждевременных родов не был обнаружен АВ (p<0,01). Распространенность КВВ в трех группах статистически не различалась, что позволяет сделать вывод об отсутствии изолированного влияния КВВ, перенесенного в I триместре, на имплантацию, плацентацию и прогрессирование беременности.
Сочетание различных инфекционных нозологий (микст-инфекций) в ранние сроки у женщин, беременность которых завершилась спонтанным выкидышем, наблюдалось в 41,7% случаев, что значительно превышало аналогичные показатели в группах срочных (13,1%, p<0,01) и преждевременных родов (14,3%, p<0,01). Обнаружение смешанной инфекции – БВ и КВВ – при неблагоприятных исходах беременности составляло 10,5% (n=16), БВ и АВ – 1,3% (n=2), БВ, АВ и хламидийной инфекции – 0,65% (n=1). При этом наиболее распространенной комбинацией инфекций было сочетание БВ с КВВ, что указывает на значимость этого сочетания как фактора риска нарушения течения беременности. Риски инфекционно-индуцированного спонтанного выкидыша увеличиваются в 4 раза при выявлении у беременных в I триместре смешанной инфекции (БВ в сочетании с КВВ) (ОР=4,2; p<0,01).
Для того, чтобы установить наличие взаимосвязей между отдельными представителями условно-патогенного микробиома вагинального биотопа в I триместре и различными исходами беременности, был проведен сравнительный анализ их распространенности и концентрации в трех сравниваемых группах (табл. 2). Частота обнаружения БВ-ассоциированных микроорганизмов в составе влагалищной микрофлоры в ранние сроки беременности была статистически значимо выше среди женщин с неблагоприятными исходами. Частота выявления A. vaginae во II группе (57,1%) и в группе спонтанного выкидыша (45,8%) была значимо выше, чем в группе срочных родов (18%, p=0,025 и p=0,009 соответственно). Наличие М. hominis в составе влагалищного микробного сообщества в I триместре подтверждалось лишь у 4,1% женщин, чья беременность закончилась родами в срок. По сравнению с участницами I группы, М. hominis регистрировали в 4 раза чаще среди пациенток III группы (в 16,7% случаев, p=0,023) и в 6,9 раз чаще – в группе преждевременных родов (28,6% p=0,007), что может подтверждать участие БВ-ассоциированных патогенов в развитии неблагоприятных исходов беременности. Среди трех потенциальных семейств-возбудителей АВ, выявляемых тестом АмплиПрайм-ФЛОРОСКРИН, статистически значимые различия по частоте выявления из влагалища женщин сравниваемых выборок получили для Streptococcus spp., который обнаруживали в I триместре у 62,5% женщин со спонтанным выкидышем, что почти в 2 раза превышало аналогичные значения в I группе (34,4%, p=0,044). Лактобациллы были обнаружены в 100% исследуемых образцов.
Число условно-патогенных бактерий, одновременно выделяемых из влагалища одной пациентки в I триместре, достигало 4,5 вида на одну участницу в группе раннего спонтанного выкидыша, что статистически значимо превышало данный показатель в группе срочных родов (3,1 вид, p<0,01) и было сопоставимо со II группой (4,4 бактериальных вида на одну женщину).
Интенсивность обсемененности вагинального биотопа различными видами условно-патогенных микроорганизмов среди женщин сравниваемых выборок распределилась следующим образом (табл. 3): медиана концентрации G. vaginalis в группе срочных родов была значительно меньше (5 [4–6,5] ГЭ/мл) по сравнению с группой раннего спонтанного выкидыша (7,5 [5,9–7,7] ГЭ/мл, p=0,047). Другой представитель БВ-ассоциированных микроорганизмов – U. parvum, определялся в большей концентрации у женщин, чья беременность закончилась прерыванием в первой половине (6,7 [6,1–7,1] ГЭ/мл) по сравнению с группой срочных родов (5,5 [5–6,1] ГЭ/мл, p=0,006). Отсутствие выявления U. urealyticum и C. glabrata в группе преждевременных родов может быть обусловлено небольшой выборкой пациенток. Интенсивность обсемененности Lactobacillus spp. значимо не различалась в исследуемых группах и составила: 7,8 [7,4–8,3] ГЭ/мл – в группе срочных родов, 7,9 [6–8,3] ГЭ/мл (p=0,323) – в группе преждевременных родов и 7,7 [6,8–8] ГЭ/мл (p=0,101) – у женщин с ранним спонтанным выкидышем.
Методом анализа факторных соответствий по результатам теста АмплиПрайм-NCMT было установлено, что одновременное обнаружение 4 и менее условно-патогенных представителей влагалищных бактерий в ранние сроки беременности, является прогностически благоприятным критерием, указывающим на высокую вероятность завершения беременности в срок (p<0,01). Напротив, наличие более 5 микроорганизмов-маркеров, участвующих в развитии БВ, АВ и КВВ, а также УПГМ, обнаруженных во влагалище одной беременной в I триместре с помощью тестов АмплиПрайм ФЛОРОСКРИН на основе ПЦР-РВ, ассоциировалось с развитием спонтанного выкидыша в I триместре и преждевременных родов (p<0,01).
Обсуждение
Проведенное исследование подтверждает наличие взаимосвязи между состоянием цервико-вагинального микробиома в ранние сроки беременности и исходами гестационного процесса. Среди женщин c неблагоприятным завершением беременности (выкидыш, преждевременные роды) чаще верифицировали диагнозы БВ, АВ, ИППП, что соответствует литературным данным об ассоциации указанных цервико-вагинальных синдромов и нозологий с осложнениями гестации [8, 13–17]. Перенесенный в первой половине беременности КВВ, как было неоднократно продемонстрировано в ранних работах [18], не связан с повышением риска выкидыша и рождения недоношенных детей.
Для оценки влияния количественных и качественных показателей цервико-вагинального микробиома в ранние сроки на исходы гестации ретроспективно участницы исследования сформировали 3 группы сравнения. Полученные результаты показали статистически значимое увеличение распространенности БВ среди женщин со спонтанным выкидышем и преждевременными родами, основными представителями которого являются G. vaginalis и A. vaginae, формирующие, как известно, биопленки – основной «патогенетический субстрат» БВ [19]. Как показано в работах Swidsinski A. et al. (2013) [19, 20], биопленки, созданные условно-патогенной G. vaginalis, способны «мигрировать» из влагалища в эндометрий и маточные трубы, что отчасти объясняет механизмы ранних репродуктивных потерь при БВ и позволяет рассматривать данный синдром как значимый фактор риска гестационных осложнений.
Частота встречаемости и концентрация БВ-ассоциированных микроорганизмов в составе цервико-вагинального микробиома в ранние сроки беременности была статистически значимо выше среди женщин с неблагоприятными исходами. Не исключено, что механизмы инфекционно-индуцированной аномальной плацентации (как одной из причин преждевременных родов) реализуются за счет способности патогенов к активации макрофагов, что, в итоге инициирует каспазозависимый апоптоз в клетках трофобласта [21].
Условно-патогенные микоплазмы (U. parvum, U. urealyticum и М. hominis) нередко рассматривают в качестве самостоятельных инфекционных факторов риска субфертильности и прерывания беременности в любых сроках. Полученные нами данные полностью согласуются с результатами ранее проведенных исследований [13, 22], указывающих на более высокую частоту встречаемости U. parvum и М. hominis среди беременных с преждевременными родами, а также отсутствие негативного влияния U. urealyticum на течение гестационного процесса. Кроме того, удалось обнаружить, что вид U. parvum определялся в более высокой концентрации у пациенток, чья беременность завершилась родами раньше 37 недель и самопроизвольным прерыванием в первой половине гестации. Нами было установлено, что М. hominis чаще выявлялась из влагалища в ранние сроки при беременности, завершившейся спонтанным выкидышем, но в концентрациях, сопоставимых с группой «срочных родов» и в более высоких значениях, полученных от женщин с преждевременным завершением гестации.
Однако рассмотрение U. parvum и М. hominis в качестве единственных «терапевтических мишеней» в настоящее время не рекомендуется, так как применение различных схем антибактериальной терапии не улучшает исходы беременности при обнаружении условно-патогенных микоплазм [13]. Целесообразно рассматривать указанные микроорганизмы исключительно в контексте БВ [22, 23].
По сравнению с обследуемыми, родившими в срок, АВ чаще диагностировался у женщин, чья беременность завершилась ранним выкидышем. Диагноз «АВ» не был установлен в I триместре среди пациенток с преждевременными родами, однако анализ полученных нами данных показал, что развитие выкидыша значимо чаще сопровождается увеличением частоты выявления условно-патогенных бактерий Staphylococcus spp., Streptococcus spp. и Enterobacteriaceae spp., участвующих в развитии АВ, что согласуется с литературными данными [10].
По нашим данным, КВВ не влиял на исходы гестации.
Известно, что микст-инфекции встречаются в 30% эпизодов вагинитов, при этом их возбудители усугубляют характер течения заболевания [24]. Ранее мы показали [14], что наличие в III триместре диагноза «микст-инфекции» нижних отделов репродуктивного тракта, объединяющей два или более самостоятельных синдрома/заболевания, ассоциировалось с риском преждевременных родов. Однако, данные о негативном влиянии смешанных инфекций, перенесенных в ранние сроки гестации, на исход беременности в доступной литературе отсутствовали. В настоящей работе нам удалось установить, что сочетание различных инфекционных заболеваний влагалища в I триместре у пациенток, чья беременность завершилась самопроизвольным прерыванием в I триместре и преждевременными родами, регистрировалось в 4 раза чаще по сравнению с женщинами, родившими срок.
Результаты сравнения среднего количества условно-патогенных микроорганизмов, колонизирующих цервико-вагинальный биотоп в I триместре (из 13 определяемых ключевых «маркеров» цервико-вагинальных инфекций), согласовались с данными литературы о более низком микробном разнообразии влагалищного микробиома при физиологическом течении гестации [25, 26]. Максимальное видовое разнообразие указанной локализации было зарегистрировано у женщин с самопроизвольным выкидышем и преждевременными родами по сравнению с пациентками, родившими в срок.
Заключение
Инфекции нижнего отдела женской репродуктивной системы, перенесенные в I триместре, ассоциируются с повышением риска ранних потерь беременности и преждевременных родов. Вопрос, являются ли инфекционные заболевания влагалища или конкретные патогены причиной самопроизвольных выкидышей и преждевременных родов, или, наоборот, аномальный микробиом лишь участвует в реализации патофизиологического процесса, индуцированного иными факторами, остается открытым, необходимо продолжить исследования в данном направлении для успешного «управления» инфекционными факторами с целью снижения репродуктивных потерь.
