В связи с усовершенствованием методов молекулярно-генетической диагностики и развитием фетальной медицины определение причин неиммунной водянки плода (НИВП) приобретает особую актуальность. Согласно данным современных литературных источников, НИВП характеризуется не только как патологическое скопление жидкости в двух и более серозных полостях плода, но и поражение одной серозной полости в совокупности с генерализованным отеком кожи (более 5 мм) или кистозной гигромой шеи плода [1–5]. Многоводие и утолщение плаценты часто являются сопутствующими ультразвуковыми находками, связанными с НИВП. Причины НИВП разнообразны; однако данные многих исследований свидетельствуют о том, что одной из наиболее частых причин являются хромосомные нарушения у плода, частота которых колеблется в широких пределах – от 8 до 80% случаев [6–9].
Общая частота НИВП, по разным данным, варьирует от 1 на 1700 до 1 на 1300 беременностей во всем мире [10–12]. В целом большинство авторов сходятся во мнении, что НИВП значительно ухудшает прогноз течения беременности, повышая частоту таких осложнений, как антенатальная гибель плода, преждевременные роды, мертворождение, неонатальная заболеваемость и смертность. Прогноз в каждом конкретном случае зависит от гестационного срока манифестации НИВП, своевременности постановки диагноза, наличия хромосомной патологии у плода, проведенной терапии, метода родоразрешения и своевременного оказания терапевтической или хирургической помощи новорожденному [5, 13–16].
При проведении комбинированного пренатального скрининга в I триместре наиболее частыми аномалиями являются кистозные гигромы или генерализованный отек у плода [6, 17]. В основном данные пациентки направляются на прерывание беременности в связи с неблагоприятным прогнозом для плода, а исследование аутопсийного плодового материала впоследствии не проводится. Однако не во всех случаях причиной данных аномалий является спонтанное нарушение числа хромосом, имеющее низкую вероятность повторения, и не у всех плодов в дальнейшем на антенатальном этапе проявляется НИВП. Таким образом, пренатальная диагностика НИВП имеет важное значение для выбора тактики ведения беременности, оценки прогноза развития как данного плода, так и риска рецидива НИВП при последующих беременностях у супружеской пары. В нашей стране инвазивная пренатальная диагностика (ИПД) при НИВП чаще проводится с применением цитогенетического исследования. Количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция (QF-PCR) и метод молекулярного кариотипирования с использованием ДНК-микроматриц (ХМА) в настоящее время не внедрены в алгоритм обследования на пренатальном этапе. Метод QF-PCR основан на мультиплексной ПЦР с использованием флуоресцентно меченных праймеров, ограничивающих полиморфные короткие тандемные повторы. Его преимуществами являются быстрое (в течение 2–3 рабочих дней) выявление часто встречающихся хромосомных анеуплоидий и невысокая стоимость исследования. Молекулярное кариотипирование – это метод молекулярно-генетического исследования кариотипа, в основе которого лежит гибридизация ДНК с микроматрицами. ХМА позволяет получить информацию о микроскопических и субмикроскопических вариациях числа копий (CNV) в геноме [18]. Преимуществами ХМА, помимо разрешающей способности, являются требования к материалу (не нужны делящиеся клетки, что позволяет значительно быстрее проводить исследование амниотической жидкости) и меньшая субъективность исследования.
Внедрение в широкую клиническую практику данных методов позволит оптимизировать тактику ведения беременности и расширить понимание генетических причин НИВП.
В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явилось изучение роли хромосомных аномалий и оптимальных методов их генетического тестирования при установленном диагнозе НИВП.
Материалы и методы
Было проведено проспективное исследование, включавшее анализ данных 43 беременных, обратившихся на перинатальный консилиум ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ с установленным диагнозом НИВП в гестационных сроках от 11 до 30 недель в период с сентября 2021 г. по ноябрь 2023 г. Ультразвуковые маркеры НИВП включали: отек воротникового пространства, кистозные гигромы шеи, генерализованный отек, асцит, гидроторакс. Все пациентки были консультированы генетиком на пренатальном консилиуме и госпитализированы во 2-е акушерское отделение патологии беременности с целью проведения ИПД. На пренатальном этапе проводились: анкетирование, общеклинические методы обследования, инструментальные методы диагностики, такие как экспертное ультразвуковое исследование с измерением максимальной систолической скорости кровотока в средней мозговой артерии, инфекционный скрининг и ИПД, включающая трансабдоминальный хориоцентез (ТХ) или трансабдоминальный амниоцентез (ТА).
После получения формы информированного согласия пациенткам была предложена ИПД. В условиях стационара проводилось взятие образов ворсин хориона (ВХ) или амниотической жидкости (АЖ) путем ТХ или ТА. ТХ и ТА выполнялись в сроках 11–14 и 15–30 недель беременности соответственно. Полученный материал направлялся на инфекционный скрининг, который включал определение методом ПЦР парвовируса В19, вируса Эпштейна–Барр, цитомегаловируса, вирусов простого герпеса типов 1 и 2, и бактериологическое исследование АЖ. Первый этап генетической диагностики заключался в выявлении аномалий хромосом 13, 18, 21, Х, Y с помощью QF-ПЦР. В случае отсутствия основных анеуплоидий у плода на втором этапе проводилось ХМА. Во всех случаях в связи с риском контаминации материнским материалом проводилась QF-ПЦР биоматериала матери и плода (рис. 1).
В исследование не включены женщины с многоплодной беременностью, с НИВП, обусловленной нарушением ритма сердца плода, крестцово-копчиковой тератомой.
Были проанализированы течение и исходы беременностей в 3 группах в зависимости от гестационного срока манифестации НИВП: группа 1 – с 11 недель до 13+6 недель (n=14); группа 2 – с 14 недель до 21+6 недель (n=13); группа 3 – с 22 до 30 недель (n=16). Исходы беременностей вышеперечисленных групп были представлены прерыванием беременности по медицинским показаниям, антенатальной гибелью плода, живорождением с явлениями НИВП и живорождением без признаков НИВП. Клиническое наблюдение за пациентками проводилось путем изучения медицинской документации и с помощью телефонных опросов с последующим подтверждением информации в виде официальных документов из медицинских учреждений.
Геномную ДНК извлекали из ВХ и АЖ с использованием набора IGENatal kit согласно инструкции производителя. Исследование методом QF-ПЦР проводилось с помощью наборов ТУ 21.20.23-113-46482062-2021 на базе Института репродуктивной генетики ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ.
ХМА выполняли с использованием системы GenoScan3000 на микроматрицах CytoScan Optima (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколу производителя. Анализ полученных данных производился с помощью программного обеспечения ChАS (Сhromosome Аnalysis Suite). Полученные CNV интерпретировались по пяти категориям, опираясь на критерии ACMG. При интерпретации в соответствии с рекомендациями оценивались размер, место расположения вариаций числа копий генов и генный состав. Анализ клинической значимости CNV проводился с использованием общедоступных баз, включая базу данных геномных вариантов (DGV), онлайн-менделевское наследование у человека (OMIM), ISCA, DECIPHER, а также данные мировой литературы. В отчет выносились патогенные и вероятно патогенные вариации числа копий генов; варианты неясной клинической значимости включались только при высоком соответствии с клинической картиной. Также проводилось обследование родительского биоматериала (периферическая кровь) с целью определения наследования CNV.
Статистический анализ
Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения Microsoft Excel (США). Качественные показатели выражены в абсолютных и относительных величинах (%), количественные показатели выражались в виде медианы (Me), интерквартильного размаха (Q1; Q3), среднего арифметического (М), стандартного отклонения (SD). Для проверки статистической значимости был использован точный тест Фишера. Уровень значимости p считали значимым при p<0.05. Однако в связи с тем, что сравнивались 3 группы, была применена поправка Бонферрони. При попарном множественном сравнении групп между собой p считали значимым при значении <0,017.
Для попарных сравнений использовали поправку Сидака.
Результаты
В рамках проведенного исследования были проанализированы клинические и анамнестические данные 43 беременных, включенных в исследование. Возраст пациенток был сопоставим в группах сравнения (табл. 1). Значение p во всех случаях сравнения >0,017.
Данные репродуктивного анамнеза, представленные в таблице 2, были сопоставимы среди пациенток исследуемых групп. Значение p во всех случаях сравнения >0,017.
Ранняя стадия манифестации НИВП была установлена у 14/43 беременных (32,5%). Это были изменения, диагностированные на пренатальном скрининге I триместра в сроках от 11 недель до 13+6 недель (группа 1). Во всех наблюдениях пациентки прошли консультацию генетика, была рекомендована ИПД. В среднем срок диагностики при ранней манифестации НИВП составил 12+5 недель. Образцы, исследованные в I триместре, включали в 14/14 (100%) случаев биоматериал ВХ. QF-ПЦР была выполнена во всех случаях. Хромосомные анеуплоидии были установлены в 10/14 (71,4%) случаев на основании анализа биоматериала плода: 6/14 (42,9%) – кариотип плода 45,Х0; 3/14 (21,4%) – трисомия 21; 1/14 (7,1%) – трисомия 18. В 4/14 (28,6%) случаев хромосомных анеуплоидий не было установлено, в связи с чем был выполнен ХМА биоматериала плодов, и в 1/4 случае был диагностирован синдром Ди Джорджи.
Манифестация НИВП в сроках более 14 недель была в 29/43 (67,4%) случаев: с 14 недель до 21+6 недели (группа 2) – в 13/43 (30,2%) случаев, с 22 по 30 недель (группа 3) – в 16/43 (37,2%) случаев (табл. 2). QF-ПЦР и ХМА были выполнены во всех случаях, и во всех 29 случаях хромосомных анеуплоидий, микроделеций и микродупликаций установлено не было (рис. 2).
Как видно из представленных данных, хромосомные нарушения были выявлены только у 11/14 (78,6%) пациентов группы 1, различия с группами 2 и 3 статистически значимы, p<0,001 (табл. 3).
Данные сроков манифестации и исходов беременности плодов с НИВП отражены в таблице 4.
Частота прерывания беременности по медицинским показаниям статистически значимо различалась в группах сравнения и была наибольшей в группе 1 и наименьшей – в группе 3. Частота неразвивающейся беременности была сопоставимой в группах сравнения. Частота живорождения была наибольшей в группе 3, однако различия не достигли уровня статистической значимости. Частота антенатальной гибели плода в группах 2 и 3 была статистически значимо выше, чем в группе 1.
Таким образом, в группе 1 хромосомные нарушения были установлены в 11/14 (78,6%) случаев – все эти беременности были прерваны по медицинским показаниям. В результате того, что в 3/14 (21,4%) случаев генетический фактор не был найден, беременности были пролонгированы.
В 2 из 3 случаев беременности протекали физиологично, признаки НИВП регрессировали, и произошло живорождение в сроках 35–36 недель детей без признаков водянки. В 1 из 3 случаев произошла антенатальная гибель плода в сроке 21 неделя беременности.
После получения результатов нормального молекулярного кариотипа в группе 2 в 4/13 (30,8%) случаев проведения повторного пренатального консилиума семейными парами было принято решение о прерывании беременности в связи с нарастанием тяжести НИВП, крайне неблагоприятным прогнозом для жизни плода. В 9/13 (69,2%) случаев беременность была пролонгирована, однако в 5/13 (38,4%) случаев была диагностирована антенатальная гибель плода (в 2 из 5 случаев причина НИВП, вероятно, была обусловлена наличием цитомегаловирусной и парвовирусной инфекций). Медиана срока беременности при антенатальной гибели составила 24 недели (23; 27).
В 4/13 (30,8%) случаев беременности протекали без осложнений. В 2 из 4 случаев явления водянки регрессировали, и в сроке 35 недель произошли преждевременные роды – дети растут и развиваются согласно возрасту. В 1 из 4 случаев произошли своевременные оперативные роды в сроке беременности 38 недель. Родился живой доношенный мальчик без признаков водянки. В 1 из 4 случаев в связи с ухудшением течения НИВП, неблагоприятным прогнозом для жизни плода после диагностики нормального кариотипа было предложено прерывание беременности; однако семья от прерывания беременности отказалась, и в сроке 26 недель в связи с преждевременным излитием околоплодных вод произошли преждевременные самопроизвольные роды. Ребенок прожил 7 суток.
После получения результатов об отсутствии хромосомной патологии в группе 3 все беременности были пролонгированы в связи с отсутствием грубых пороков развития плода. В 7/16 (43,7%) случаев произошла антенатальная гибель плода; так, медиана срока беременности при антенатальной гибели составила 26 недель (24; 27). В 9/16 (56,3%) случаев имело место живорождение, медиана срока родоразрешения составила 38 недель (34; 39); оценка по шкале Апгар на 1-й минуте – от 1 до 8 баллов, на 5-й минуте – от 3 до 8 баллов; новорожденные наблюдались и проходили лечение в отделениях интенсивной терапии. В 5 из 9 случаев была зафиксирована младенческая смертность в возрасте от 3 ч жизни до 9 месяцев; из них 4 случая относились к ранней неонатальной смертности, 1 случай – к младенческой смертности. В 1 случае у ребенка был диагностирован кистозно-аденоматозный порок верхней доли левого легкого, однако в связи с осложнением текущего заболевания, особенностями послеоперационного периода была зафиксирована поздняя неонатальная смерть на 15-е сутки жизни. В 4 из 9 случаев к моменту рождения детей явления водянки регрессировали; были рождены здоровые дети с оценкой по шкале Апгар на 1-й минуте – от 6 до 8 баллов, на 5-й минуте – от 7 до 8 баллов; в настоящее время растут и развиваются согласно возрасту. В данных наблюдениях генетической причины НИВП на данном этапе диагностировано не было.
Обсуждение
В результате проведенного исследования было установлено, что хромосомные аномалии представляют собой наиболее распространенную причину НИВП в I триместре и связаны с более высоким риском перинатальных потерь, что согласуется с данными исследований других авторов [5, 12, 16, 19]. Среди хромосомных анеуплоидий наиболее часто встречались синдром Шерешевского–Тернера (13,9%), синдром Дауна (6,9%) и синдром Эдвардса (2,3%), что также соответствует результатам многоцентровых исследований [6, 9]. Согласно данным мировой литературы, при гестационном сроке более 14 недель хромосомные нарушения при НИВП встречаются в 4–20% случаев [7, 19]. В нашем исследовании у пациенток со сроком беременности более 14 недель не было диагностировано хромосомных аномалий. Было установлено, что уровень живорождения выше в тех случаях НИВП, когда клинические проявления возникали на более поздних сроках, что также согласуется с данными других исследователей [6, 9, 16, 17, 19].
Проведенное исследование продемонстрировало необходимость проведения ИПД, место и преимущества каждого из методов генетического тестирования, проводимого пренатально при НИВП. Выбор метода тестирования напрямую зависит от сроков манифестации, наличия дополнительных ультразвуковых маркеров хромосомных заболеваний или пороков развития плода, сроков проведения ИПД, а также дальнейшей тяжести течения НИВП. Внедрение метода ХМА увеличивает количество обнаруженных хромосомных аномалий. Основываясь на вышеперечисленных данных, возможно подтверждение или исключение хромосомной патологии в кратчайшие сроки, что помогает оптимизировать тактику ведения текущей беременности в каждом конкретном случае. Однако данные методы не позволяют обнаружить патологию, вызванную нарушением функции одного гена, то есть не позволяют диагностировать моногенные заболевания: аутосомно-доминантные (в частности, РАСопатии) или аутосомно-рецессивные, которые могут являться причиной НИВП [6, 17]. Таким образом, при верификации нормального молекулярного кариотипа дальнейший диагностический поиск будет продолжаться в направлении проведения секвенирования полного экзома, что улучшит выявляемость причин, лежащих в основе НИВП [4, 20–22].
Заключение
В связи с разными сроками манифестации, многообразием клинических проявлений и возможных исходов при НИВП генетическое консультирование супружеских пар в каждом конкретном случае должно основываться не только на полученных данных о нормальном кариотипе, но также учитывать наличие аномалий развития плода, их совместимости с жизнью ребенка, тяжесть водянки на антенатальном этапе, в том числе при динамическом наблюдении. Данная информация помогает определить прогноз для плода, возможности терапии и целесообразность пролонгирования текущей беременности. Данные генетического тестирования особенно актуальны при консультировании семейных пар не только по поводу прогноза текущей беременности, но и для оценки риска повтора НИВП при последующих беременностях в данной семье.
