Миома матки представляет собой важную медицинскую и социальную проблему в связи с ее широкой распространенностью, неясным этиопатогенезом, отсутствием оптимальных алгоритмов лечения и профилактики данной патологии. В общей структуре гинекологических патологий миома матки занимает второе место после воспалительных заболеваний органов малого таза. У 25–75% женщин миома матки диагностируется в репродуктивном возрасте, 5–10% из них страдают маточной формой бесплодия [1–3].
У женщин репродуктивного возраста, планирующих беременность, наиболее эффективным методом лечения симптоматической миомы матки является миомэктомия. Однако при таком подходе существует высокая вероятность развития рецидива заболевания практически у 90% пациенток. Повторному хирургическому вмешательству подвергаются 27% пациенток, оперированных по поводу одиночной миомы матки, и 59% пациенток, оперированных по поводу множественной миомы матки [1, 2, 4–7].
Радикальным способом предотвращения рецидивов лейомиомы является гистерэктомия; однако этот вариант неприемлем для женщин, планирующих беременность. Более того, существенной проблемой, возникающей в результате миомэктомии, является травматизация матки, возникновение рубцов, приводящих к нарушению ее нормального функционирования в период беременности и риску разрывов при растяжении и сокращении до и после родов. Кроме того, именно в период беременности скорость роста узлов миомы оказывается максимальной, что связывают с высоким уровнем прогестерона в крови [8]. Таким образом, одной из наиболее значимых медико-социальных проблем терапии лейомиомы является разработка методов лечения, позволяющих предотвращать рецидивирование заболевания у пациенток, планирующих беременность, либо находящихся в процессе вынашивания. Таким образом, систематизация существующих методов предотвращения рецидивирования лейомиом или замедление роста имеющихся узлов у пациенток, планирующих деторождение или имеющих беременность, имеет высокую актуальность.
Миома матки является моноклональной доброкачественной опухолью, происходящей из миоцитов шейки и/или тела матки [1]. Считается, что каждый миоматозный узел вырастает из одной первичной клетки, в которой произошел генетический сбой – так называемая «драйверная мутация» [9]. Такими мутациями могут быть перестройки в локусах 6p21 и 10q22, делеции в локусах 1p и 3q [9,10,11], а также соматические мутации в гене MED12, ведущие к изменениям экспрессии генов HGMA1, HGMA2, FH, BHD, TSC2, PCOLCE, ORC5L, LHFPL3, ESR2 и RAD51 в тканях миоматозных узлов [12]. Установлено, что множественные миоматозные узлы в одной и той же матке могут иметь разные генетические дефекты, что еще раз свидетельствует об изолированном развитии каждого миоматозного узла [10, 13].
Наиболее значимой соматической мутацией являются мутации в гене MED12, которые выявляются в миомах у 50–70% пациенток. Чаще всего это миссенс-мутации в кодонах 43 и 44, а также делеции различной протяженности. Ген MED12 расположен на Х-хромосоме и кодирует белок массой 250 кДа, представляющий собой субъединицу большого медиаторного комплекса, участвующего в регуляции транскрипции комплекса РНК-полимеразы II. Роль мутаций в гене MED12 в развитии лейомиом еще предстоит выяснить. Предполагают, что такие мутации могут менять функциональные свойства белка MED12, и такой мутантный белок меняет работу комплекса РНК-полимеразы II в клетках растущей лейомиомы, что ведет к изменениям активности других генов, кодирующих белки, участвующие в росте и развитии опухолей [14, 15].
Показано, что клетки миоматозных узлов в сравнении с тканями морфологически не измененного миометрия имеют значимые эпигенетические изменения. В миоматозных клетках выявлены изменения в уровне метилирования промоторов и сопутствующие им изменения в экспрессии мРНК в 55 генах [16]. Также были выявлены различия в уровне метилирования и экспрессии РНК в 120 генах между клетками лейомиомы и нормальными клетками морфологически не измененного миометрия [17].
В целом исследования различий экспрессионного профиля миометрия и миом различных молекулярных фенотипов ведут к дальнейшему развитию и совершенствованию подходов к индивидуализации прогноза течения и лечения миомы матки у пациенток. Кроме того, такие исследования выявляют потенциальные гены-мишени для развития новых методов терапевтического воздействия на опухоли и профилактики развития заболевания.
Цель исследования: изучение дифференциальной экспрессии генов в миоматозных узлах и миометрии как основы для дальнейших разработок персонализированных подходов к диагностике, прогнозированию течения и подходов к лечению миомы матки.
Материалы и методы
Материал исследования представлен 133 образцами тканей миоматозных узлов (85 образцов) и тканей морфологически не измененного миометрия (48 образцов), полученных от 48 женщин, оперированных по поводу миомы матки в отделении оперативной гинекологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова», а также гинекологических отделениях ФГБУ «Центральная клиническая больница с поликлиникой» Управления делами Президента Российской Федерации и ГБУЗ «ГКБ № 15 ДЗМ» в 2022–2023 гг.
Молекулярно-генетическое исследование проводили в лаборатории молекулярно-генетических методов и онкологической генетики Института репродуктивной генетики ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.
На основании биоинформатического анализа отобрано 18 генов-кандидатов (HMGA2, PAPPA1, GRPR, TYMS, PLAG1, VCAN, AVPR1A, ESR1, PLA2R1, RANKL, KLF11, KRT19, MMP11, ADAM12, MMP16, PCP4, SATB2, WIF1), предположительно вовлеченных в патогенез миомы матки [18–20].
Образцы каждого миоматозного узла, удаленного у пациенток, анализировали на наличие соматических мутаций во втором экзоне гена MED12 методом секвенирования по Сэнгеру. С целью подтверждения соматической природы мутаций также секвенировали последовательность экзона 2 гена MED12 в образцах периферической крови всех пациенток.
Уровень экспрессии генов HMGA2, PAPPA1, GRPR, TYMS, PLAG1, VCAN, AVPR1A, ESR1, PLA2R1, RANKL, KLF11, KRT19, MMP1, ADAM12, MMP16, PCP4, SATB2, WIF1 в образцах ткани миоматозных узлов и морфологически не измененного миометрия измеряли с помощью метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Реакцию ставили в двух повторах. Для каждого маркера рассчитывали среднее значение Сt по методике Бурменской О.В и соавт. [21]. По завершении амплификации рассчитывали уровень представленности транскриптов методом сравнения индикаторных циклов (метод ∆Ct) с нормировкой относительно нормировочного фактора, рассчитанного по референсным генам B2M, GUSB [22]. За 1 было принято значение медианы (Ме) в группе сравнения, относительно этого значения рассчитываются показатели экспрессии в образцах.
Статистический анализ
Статистический анализ осуществляли с помощью пакета программ IBM SPSS Statistics 17.0. Статистически значимыми считали различия при уровне р<0,05. В качестве меры центральной тенденции в группах исследования рассчитывали медиану (Me). Данные по группам исследования представлены в виде значений медиан (Me), 1-го и 3-го квартилей (Q1; Q3).
Результаты и обсуждение
Из 48 пациенток исследуемой выборки 29 женщин были оперированы по поводу одиночной миомы матки и 19 – по поводу множественной миомы матки.
В образцах периферической крови ни одной из 48 пациенток мутации в гене MED12 не были обнаружены, что свидетельствует о соматическом происхождении (в клетках-предшественниках миомы матки) этих мутаций.
В таблице 1 представлены результаты тестирования на наличие мутаций в гене MED12 образцов миоматозных узлов 48 пациенток исследуемой выборки.
Среди пациенток, оперированных по поводу одиночной миомы матки, у 13 в образцах миоматозных узлов были обнаружены соматические мутации в гене MED12, у 16 соматических мутаций в гене MED12 не обнаружено. У 4 пациенток, оперированных по поводу множественной миомы матки, мутации в гене MED12 обнаружены во всех 30 миоматозных узлах. У 6 пациенток в 26 миоматозных узлах мутации в гене MED12 не обнаружены. Кроме того, у 9 пациенток с множественной миомой среди 29 миоматозных узлов были выявлены как узлы с мутацией MED12, так и без мутации.
В таблице 2 представлены результаты сравнительного анализа уровня экспрессии 18 генов в образцах миометрия и образцах миоматозных узлов исследованной выборки в целом.
В миоматозных узлах в общей выборке наблюдается значимо повышенная экспрессия генов GRPR, TYMS, RANKL и MMP11 и значимо пониженная экспрессия генов KLF11 и KRT19 по сравнению с миометрием. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении генов GRPR, TYMS, RANKL, MMP11 в патогенез миомы матки, независимо от наличия или отсутствия соматических мутаций в гене MED12. Кроме того, наблюдается заметная разница в средних значениях экспрессии по гену HMGA2, известному как один из ключевых генов, гиперэкспрессия которого ведет к развитию миомы матки [21]; однако p-value по этому гену не поддерживает достоверности отличия. Это вызвано в первую очередь чрезвычайно сильным разбросом данных внутри группы миоматозных узлов, что потребовало разделения общей группы на подгруппы для дальнейшего анализа.
Известно, что гены GRPR, TYMS, RANKL и MMP11 часто сверхэкспрессируются в некоторых онкологических опухолях (в частности, при раке молочной железы, легких, меланоме и некоторых других) [23–25]. В то время как гены KLF11 и KRT19 демонстрируют сниженную активность именно в миомах, главным образом за счет метилирования промоторных областей этих генов в клетках опухолей [26].
Следующим этапом анализа полученных данных было сопоставление данных по миоматозным узлам с мутацией в гене MED12 и без мутации с данными по миометрию. В таблице 3 представлены показатели уровня экспрессии исследованных генов в миометрии и миоматозных узлах MED12+.
В миоматозных узлах с соматическими мутациями в гене MED12 наблюдается значимо повышенная экспрессия тех же генов, что упоминались выше при анализе общей выборки узлов, – GRPR, TYMS, RANKL MMP11; однако выявлено значимое повышение экспрессии еще по трем генам: AVPR1A, PCP4 и ESR1. Именно для узлов MED12+ характерен повышенный уровень экспрессии эстрогенового рецептора (ESR1) в клетках миом, что приводит к усилению ответа на эстроген и росту опухоли. Продукт гена AVPR1A является рецептором вазопрессина и участвует в механизмах регуляции и пролиферации клеток некоторых опухолей (в частности, карциномы щитовидной железы) [27].
Как показано в таблице 3, в миоматозных узлах с соматическими мутациями в гене MED12 статистически значимо снижена экспрессия не только генов KRT19, KLF11, но и гена WIF1 по сравнению с миометрием. Ген WIF1 является широко известным супрессором опухолей, который выключается в клетках при самых разных онкогенных процессах, причем снижение его активности достигается также через механизм метилирования промоторной области [28].
В таблице 4 представлены уровни экспрессии генов-кандидатов в образцах миометрия и второй подгруппы миом – миоматозных узлах без мутации в гене MED12.
В данной выборке мы наблюдаем иную картину снижения/повышения экспрессии генов, чем в узлах MED12+. По сравнению с миометрием в данной подгруппе узлов наблюдается повышенная экспрессия генов PLAG1 и RANKL в миоматозных узлах, тогда как экспрессия генов PAPPA1, ESR1, PLA2R1, KRT19, KLF11 и AVPR1A понижена по сравнению с миометрием. То есть для генов ESR1, AVPR1A ситуация прямо противоположна показателям по узлам MED12+. В разных молекулярных подтипах узлов мы видим противоположные изменения экспрессии этих генов.
Для выявления дальнейших отличий между двумя молекулярными фенотипами миомы матки был проведен сравнительный анализ экспрессии всех этих генов в образцах миоматозных узлов с соматической мутацией MED12 и без таковой. Результаты сравнительного анализа представлены в таблице 5.
Спектр различий между двумя подгруппами миоматозных узлов оказался выше, чем между каждым из этих подтипов и миометрием. Всего статистически значимые различия обнаружены по 10 генам. Для генов PAPPA1, VCAN, ESR1, RANKL, KRT19, MMP11, PCP4 и AVPR1A выявлено повышение экспрессии в MED12+ фенотипе узлов по сравнению с узлами MED12-. Для трех генов выявлена ситуация, когда один тип узлов значимо не отличается от показателей миометрия, тогда как другой – отличается (гены PLAG1, WIF1, KLF11). Пониженная экспрессия генов KRT19, KLF11 была выявлена в выборке миоматозных узлов как в целом, так и в подгруппах; при этом между подгруппами узлов значимым оказалось отличие по гену KRT19 – в подгруппе MED12+ уровень экспрессии этого гена выше, чем в подгруппе MED12-. По двум генам, GRPR и TYMS, наблюдается значимое повышение экспрессии во всех миоматозных узлах, но отсутствует разница между двумя фенотипами узлов. Для гена VCAN не выявлено значимого повышения экспрессии в узлах MED12-, хотя среднее значение отличается существенно; при этом в узлах MED12+ среднее значение еще выше, и показатель p выше, что объясняется сильным разбросом значений внутри групп. Аналогичная ситуация с геном HMGA2 – разбросы показателей экспрессии очень велики, при этом статистически значимых отличий не выявляется. Гиперэкспрессия данного гена в миомах была обнаружена довольно давно и считается ключевым моментом в генезе лейомиом, в которых происходят хромосомные перестройки, затрагивающие область 12q14-15 [29]. Однако ранее опубликованных данных об экспрессии генов, касающихся различий между лейомиомами матки с аберрациями 12q14-15 и без них, недостаточно для понимания, насколько часто гиперэкспрессия данного гена встречается в миомах в целом. Наши данные дополняют имеющуюся картину: в изученной выборке мы не обнаружили гиперэкспрессии гена HMGA2 в узлах MED12+, тогда как в группе узлов MED12- у 17/43 узлов (40%) показатели экспрессии были очень высокими. Следовательно, среди узлов MED12- существует еще одна подгруппа опухолей, характеризующаяся высокой экспрессией гена HMGA2 и требующая более детального изучения.
Стоит отметить, что большинство генов (HMGA2, PAPPA1, GRPR, TYMS, PLAG1, VCAN, AVPR1A, ESR1, PLA2R1, RANKL, KLF11, KRT19, MMP11, PCP4, SATB2, WIF1), первоначально отобранных как потенциальные патогенетические маркеры для миомы матки, продемонстрировали дифференциальную экспрессию в миомах, то есть являются так или иначе вовлеченными в развитие процесса развития опухоли.
Заключение
Результаты анализа дифференциальной экспрессии 18 генов в миомах и миометрии позволяют выделить два молекулярных фенотипа миомы матки – ассоциированный (MED12+) и не ассоциированный (MED12-) с соматической мутацией во втором экзоне гена MED12.
Ассоциированные и не ассоциированные с соматической мутацией в гене MED12 молекулярные фенотипы миоматозных узлов встречаются и при одиночной, и при множественной миоме матки. В данном исследовании показано, что при разных молекулярных фенотипах миомы матки экспрессия некоторых генов в миоматозных узлах меняется разнонаправленно, и статистически значимые отличия выявляются не только между каждым типом миомы и миометрием, но и между миомами разных молекулярных фенотипов. Все это позволяет сформулировать гипотезу о том, что разные молекулярные фенотипы миомы матки могут отличаться как профилями экспрессии генов-опухолевых маркеров, так и разным потенциалом к росту и рецидивированию, что требует дальнейших исследований. Полученные результаты позволяют рассматривать часть исследованных генов в качестве потенциальных мишеней для разработки персонализированных подходов к диагностике, прогнозированию течения, профилактике и лечению миомы матки.
