Evaluation of the ability of benzydamine hydrochloride to inhibit planktonic cells, as well as growing and mature biofilms of clinically important microorganisms


DOI: https://dx.doi.org/10.18565/pharmateca.2021.1.102-107

P.V. Slukin (1), N.K. Fursova (1), I.V. Kukes (2, 3), N.I. Briko (4)

1) State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Serpukhov, Moscow Region, Russia; 2) Angelini Pharma Rus LLC, Moscow, Russia; 3) International Association of Clinical Pharmacologists and Pharmacists, Moscow, Russia; 4) I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia
Background. Biofilms are a huge healthcare problem around the world because these formations provide additional opportunities for bacteria and fungi to resist antimicrobial drugs. Nowadays, a large range of antimicrobial drugs have been registered in Russia, however, evidence of their antagonistic activity against biofilms is limited. Benzydamine is a popular and actual local anti-inflammatory drug with antimicrobial properties that is why this is a high interest to test it against biofilms.
Objective. To form a collection of clinical isolates (gram-positive bacteria, gram-negative bacteria and yeast-like fungi), to study the sensitivity of their planktonic and biofilm cultures to the antimicrobial drug benzydamine hydrochloride.
Methods. Determination of the minimum inhibitory concentrations of benzydamine hydrochloride against test-cultures of microorganisms by the method of serial dilutions in liquid and solid nutrient media.
Results. A collection of strains has been created. New data have been obtained on the sensitivity of clinically significant microorganisms to benzydamine hydrochloride.
Conclusions. It has been shown that planktonic cultures and biofilm-forming test-strains of Pseudomonas aeruginosa, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Gardnerella vaginalis, Staphylococcus spp., Streptococcus pneumoniae, Candida spp. are sensitive to benzydamine hydrochloride at a concentration corresponding to that in Tantum® Verde 0,15 and 0,3%. The inhibitory activity of benzydamine hydrochloride against mature biofilms of clinically significant microorganisms was also noted in the concentration range 160–1280 mg/l.
Keywords: benzydamine hydrochloride, antibacterial activity, minimum inhibitory concentration, clinical strains, biofilms

Введение

Бактерии образуют биопленки как способ оградить себя от агрессивных факторов внешней среды и выжить. Поэтому биопленки в природе встречаются очень часто. Еще в 1683 г. А. ван Левенгук наблюдал и описывал биопленки, выделенные с поверхности зубов с помощью своего примитивного микроскопа. Однако тема биопленок не особо интересовала исследователей и практикующих врачей до начала 1970-х гг., когда Н. Хойби обнаружил связь между развитием очагов хронического воспаления и большим титром бактерий у пациентов с муковисцидозом [1]. С тех пор признано, что биопленки могут быть причиной большого числа клинических осложнений распространенных заболеваний [2, 3] и вносят отдельный вклад в течение хронических инфекций [4].

Бактериальные биопленки – это скопление бактерий, прикрепленных к поверхности ткани и/или друг к другу. Вокруг этих бактерий образуется матрикс. Матрикс биопленки состоит из таких веществ, как белки (например, фибрин), полисахариды (например, альгинат) и пр. Оставаясь бездействующими и скрытыми от иммунной системы под матриксом, они могут вызывать локальное повреждение тканей, а затем острую инфекцию. Внутри биопленки бактерии адаптируются к аноксии окружающей среды и ограничению питательных веществ, демонстрируя измененный метаболизм, экспрессию генов и выработку белка, что может приводить к более низкой скорости метаболизма и уменьшению скорости деления клеток [3, 5]. Кроме того, эта адаптация делает бактерии более устойчивыми к противомикробной терапии за счет инактивации противомикробных агентов. При формировании очагов бактерий с биопленками ни врожденный, ни приобретенный иммунный ответы не могут достаточно уничтожать бактерии в биопленках, вместо этого ускоряют повреждение коллатеральных тканей [6]. Следовательно, заболевания, связанные с биопленками, обычно представляют собой стойкие инфекции, которые развиваются медленно, редко разрешаются с помощью собственной иммунной системы и сопровождаются непрогнозируемой реакцией на антимикробную фармакотерапию.

Помимо бактерий грибы рода Candida также могут формировать биопленки, например C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis и C. parapsilosis.

C. albicans являются наиболее распространенными грибковыми патогенами человека, вызывающими как инфекции на слизистых оболочках, так и системные инфекции. Это объясняется тем, что C. albicans обладает высокой способностью к адаптации, что позволяет этим микроорганизмам изменять статус комменсального микробного агента на статус агрессивного патогена благодаря имеющемуся у них набора факторов вирулентности. В частности, способность изменять морфологию и образовывать биопленки является центральным звеном в патогенезе C. albicans [7].

Стоит также отметить, что на сегодняшний день известно о двух типах биопленок – формирующиеся био и зрелые биопленки. Тип биопленки определяется стадией ее формирования. Обычно считается, что формирование биопленки происходит в течение четырех основных стадий: 1) прикрепление бактерий к поверхности, 2) образование микроколоний, 3) созревание биопленки и 4) рассредоточение бактерий, которые затем могут колонизировать новые области [8]. Этот процесс образования биопленок изображен на рис. 1.

102-1.jpg (125 KB)

Бензидамина гидрохлорид – препарат, относящийся к классу нестероидных противовоспалительных средств, но обладающий широким спектром антимикробной активности [9]. Поэтому этот препарат крайне востребован в лечении инфекционных заболеваний ротоглотки, вызываемых значительным числом видов грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Материал и методы

В исследовании использовали коллекционные (n=24) и клинические (n=17) штаммы микроорганизмов, полученные из международных и государственной коллекций и выделенные от пациентов лечебных учреждений Российской Федерации, идентифицированные и охарактеризованные в отделе молекулярной микробиологии ФБУН ГНЦ ПМБ (табл. 1, 2).

104-1.jpg (570 KB)

Штаммы P. aeruginosa, Candida spp., M. catarrhalis и Staphylococcus spp. выращивали на плотной питательной среде Mueller Hinton Agar (HiMedia Laboratories, Индия) и жидкой питательной среде Mueller Hinton Broth (HiMedia Laboratories, Индия). Для культивирования Candida spp. в питательную среду Mueller Hinton Agar добавляли глюкозу до 0,1%. Штаммы культивировали при температуре 37°C в аэробных условиях. Штаммы H. influenzae, S. pneumoniae и G. vaginalis культивировали на плотной питательной среде Шоколадный агар (ФБУН ГНЦПМБ, Оболенск, Россия) при температуре 37°C в анаэробных условиях. Микроорганизмы хранили при температуре -72°C в 20%-ном водно-глицериновом растворе.

Кристаллический препарат бензидамина гидрохлорид (Angelini Acraf S.p.A., Италия) растворяли в стерильной дистиллированной воде (стоковый раствор) до концентрации 25600 мг/л, хранили в течение 14 дней при температуре +4°C. Раствор представлял собой прозрачную жидкость, при хранении осадка не образовывалось.

Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) бензидамина гидрохлорида для планктонных клеток P. aeruginosa, M. catarrhalis, S. aureus и C. albicans определяли, согласно МУК 4.2.1890-04 [10], методом серийных разведений в бульоне с использованием концентраций препарата, равных 0,2 мг/л, 0,3, 0,6, 1,3, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280 и 2560 мг/л. МПК бензидамина гидрохлорида для планктонных клеток H. influenzae, S. pneumoniae и G. vaginalis определяли на плотной питательной среде, согласно МУК 4.2.1890-04, методом серийных разведений в агаре с использованием концентраций препарата, равных 40, 80, 160, 320, 640, 1280 и 2560 мг/л. За МПК принимали минимальную концентрацию препарата, при которой отсутствовал видимый рост тестируемой культуры микроорганизма.

Способность штаммов микроорганизмов к образованию биопленок определяли в 96-луночных планшетах, согласно методу O’Toole, 2011 [11]. Измеряли оптическую плотность на спектрофотометре Multiskan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 595 нм. Степень биопленко-образования определяли по критериям, предложенным L.B. Rodrigues et al. (2010): отсутствие биопленки при ODs≤ODnc, где ODs – оптическая плотность тестируемого образца, ODnc – оптическая плотность контрольного образца; слабое биопленкообразование при ODnc<ODs≤2×ODnc; средняя степень биопленкообразования при 2×ODnc<ODs≤4×ODnc; сильно выраженное биопленкообразование при 4×ODnc<ODs [12].

Антибиопленочную активность бензидамина гидрохлорида тестировали в 96-луночных планшетах. Тест-культуры засевали в лунки планшета до конечной концентрации 104 КОЕ/мл в объеме 0,2 мл жидкой питательной среды Mueller Hinton Broth (HiMedia Laboratories, Индия). Для определения активности препарата против растущей биопленки бензидамин гидрохлорид вносили в концентрациях 5 мг/л, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280, 2560 и 5120 мг/л сразу после инокуляции культуры, а для зрелой биопленки – через 48 часов после инокуляции. Результаты оценивали через 24 часа после внесения бензидамина гидрохлорида. Для этого удаляли культуральную среду, дважды промывали лунки физраствором и окрашивали биопленки 0,1%-ным водным раствором кристалвиолета.

МПК бензидамина гидрохлорида для биопленок микроорганизмов на плотной питательной среде проводили методом апликаторов, согласно Е.В. Детушевой и соавт. (2015) [13].

Результаты

Анализ МПК бензидамина гидрохлорида показал, что планктонные культуры подавляющего большинства использованных коллекционных штаммов (n=23) чувствительны к этому препарату с МПК от <0,2 до 1280 мг/л (табл. 3).

105-1.jpg (234 KB)

Госпитальные и коллекционные штаммы чувствительны к бензидамину, а поскольку концентрация действующего вещества в лекарственном средстве Тантум Верде, спрей, равна 1500 мг/л, эти данные могут быть экстраполированы на готовый лекарственный препарат (МПК в тестах до 1280 мг/л).

Степень биопленкообразования определена для 27 штаммов, в т.ч. M. catarrhalis (n=5), P. aeruginosa (n=8), S. aureus (n=8) и Candida spp. (n=5) (табл. 4).

106-1.jpg (176 KB)

Способность к образованию биопленок использованными штаммами микроорганизмов варьировалась от слабой до высокой как среди коллекционных штаммов, так и среди штаммов, выделенных из госпитальной среды. Интересно, что доли штаммов с разной степенью биопленкообразования в данной коллекции были равны по 9 штаммов в категориях слабого, среднего и высокого биопленкообразования. Представители разных таксонов характеризовались также разнообразием по способности к биопленкообразованию, что выявлялось как разная степень окраски лунок планшета в тесте на биопленкообразование (рис. 2).

106-2.jpg (265 KB)

В ходе исследования отмечено, что при обработке формирующейся и зрелой биопленки всех использованных штаммов микроорганизмов бензидамином гидрохлоридом в концентрации 16–1280 мг/л происходило уменьшение плотности биопленок.

МПК бензидамина гидрохлорида для зрелых биопленок штаммов микроорганизмов определены методом аппликаторов на основании способности биопленок выживать и продолжать свой рост на поверхности плотной питательной среды, содержащей серийные разведения препарата (рис. 3).

В ходе исследования показано, что зрелые биопленки штаммов M. catarrhalis и C. albicans отличались большей чувствительностью к бензидамину гидрохлориду, чем зрелые биопленки S. aureus. Штаммы всех видов зрелые биопленки отнесены к категории чувствительных к данному препарату, поскольку значения МПК были ниже концентрации бензидамина гидро-хлорида в лекарственном средстве Тантум Верде, спрей, равной 1500 мг/л (табл. 5).

107-1.jpg (131 KB)

Обсуждение

Полученные данные свидетельствуют: способность бактерий и грибов образовывать биопленки снижает антимикробную активность препаратов. Тем не менее, результаты тестов показывают, что бензидамин гидрохлорид в терапевтических концентрациях до 1500 мкг/мл оказывает выраженное антимикробное действие в отношении как планктонных клеток, так и биопленок клинически значимых микроорганизмов.

Выводы

Бензидамина гидрохлорид проявляет антимикробное действие против планктонных клеток широкого спектра штаммов бактерий и грибов в известных терапевтических и клинически значимых концентрациях.

Бензидамина гидрохлорид в концентрациях ниже таковых в препарате Тантум® Верде, спрей, 0,15 и 0,3% предотвращает формирование биопленок на тест-штаммах P. aeruginosa, M. catarrhalis, H. influenzae, G. vaginalis, Staphylococcus spp., S. pneumoniae, Candida spp.

Источник финансирования. Проект при поддержке отраслевой программы Роспотребнадзора.


About the Autors


Corresponding author: Nadezhda K. Fursova, Cand. Sci. (Biol.), Leading Researcher, Antimicrobial Agents Laboratory, Department of Molecular Microbiology, State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Moscow Region, Russia; n-fursova@yandex.ru
Address: 24 “Quarter A” Territory, 142279 Obolensk, City District Serpukhov, Moscow Region, Russian Federation 


Бионика Медиа