Введение

Заживление ран представляет собой сложный процесс, направленный на восстановление целостности кожного покрова и включающий три фазы: гемостаза/воспаления, пролиферации и ремоделирования. Сбой процессов регенерации на любом из этих этапов приводит к нарушению нормальной барьерной функции кожи [1].

В связи с этим поиск эффективных и безопасных веществ, ускоряющих и нормализующих процессы заживления, остается актуальной проблемой современной медицины. Известно, что медь является важным микроэлементом для нормального функционирования и обновления кожи, а также играет важную роль в процессе заживления ран, особенно в фазы пролиферации и ремоделирования [2].

I. Tenaud et al. (1999) провели работу, в которой оценивали влияние микроэлементов на экспрессию интегринов. По результатам исследования, медь оказывала выраженное стимулирующее влияние на синтез интегринов-a6, -b1 и -a2, расположенных на поверхности дифференцированных супрабазальных кератиноцитов в последней фазе регенерации [3]. В исследовании N. Phillips et al. (2010) показано, что медь усиливает активность матриксных металлопротеиназ (MMP)-1, -2 и -9, а также значительно стимулирует экспрессию интерлейкина-8, который активирует синтез коллагена [4]. А.А. Рахметова и соавт. (2011) в своей работе оценивали ранозаживляющие свойства мазей с наночастицами меди в экспериментальных моделях на животных и пришли к выводу: данные препараты статистически достоверно ускоряют закрытие раневых дефектов [5].

Далеко не все соединения меди могут использоваться для наружного применения. Одним из методов доставки ионов металлов в кожу является их комплексообразование с различными лигандами, среди которых аминокислоты и пептиды играют ключевую роль [6].

Общие сведения о трипептиде GHK

Медьсвязывающий трипептид GHK представляет собой молекулу небольшого размера с аминокислотной последовательностью глицил-L-гистидил-L-лизин. Впервые он был обнаружен американскими исследователями L. Pickart и Thaler в 1973 г. при сравнении влияния плазмы крови молодых (20–25 лет) и пожилых (50–70 лет) людей на работу гепатоцитов. Оказалось, что при воздействии плазмы крови молодых людей гепатоциты начинают синтезировать белки на уровне, характерном для молодого организма; в частности, отмечалось угнетение синтеза фибриногена. Причиной изменения синтетической активности гепатоцитов оказался GHK [7]. Данное открытие положило начало многолетним исследованиям свойств трипептида.

GHK обнаруживается в естественных условиях в плазме крови, слюне и в моче. Он имеет высокое сродство к иону меди Cu2+, с которым формирует хелатный комплекс GHK-Cu. С возрастом отмечается значительное уменьшение концентрации GHK-Cu в плазме крови: с 200 нг/мл у детей и молодых людей до 80 нг/мл– у лиц старше 60 лет, что может служить одним из факторов, обусловливающих сниженную регенеративную способность последних [8].

E.H. Sage et al. (1994) установили, что GHK высвобождается при расщеплении белка SPARC (Secreted protein acidic and rich in cysteine). Данный гликопротеин, являющийся компонентом экстрацеллюлярного матрикса, обнаруживается в большом количестве в эмбриональных клетках, а также в тканях, подвергающихся обширному ремоделированию и восстановлению. Считается, что SPARC регулирует форму и работу эндотелиальных клеток в процессе регенерации тканей [9]. Аминокислотная последовательность, соответствующая GHK, была также обнаружена в альфа 2 (I) цепи коллагена 1-го типа. При повреждении тканей вследствие воздействия протеаз происходит расщепление молекул коллагена и высвобождение GHK в месте травмы [10]. Таким образом, GHK является типичным матрикином – биологически активным пептидом, высвобождающимся в результате разрушения крупных белковых молекул экстрацеллюлярного матрикса [11, 12].

Биохимической особенностью трипептида GHK является его малый размер, вследствие чего к мембранным рецепторам клеток он проникает лучше, чем более крупные молекулы. Кроме того, GHK обладает уникальными медьсвязывающими характеристиками: аффинитет GHK к ионам меди Cu2+ гораздо выше, чем у аналогичных пептидов, и практически эквивалентен аффинитету молекулы альбумина. Предполагается, что GHK участвует в переносе ионов меди из кровеносного русла к тканям, а также помогает им проникать внутрь клеток в нетоксичной и легко утилизируемой форме [13]. В работах L. Mazurowska et al. (2006, 2008) показано, что комплекс GHK-Cu хорошо проходит через роговой слой эпидермиса, причем именно трипептид обеспечивает адекватную проникающую способность [6, 14]. В работе J.J. Hostynek et al. (2010) были получены аналогичные результаты, а также показано, что при наружном нанесении на кожу человека ex vivo комплекс GHK-Cu способен накапливаться в ней в концентрации, потенциально эффективной для лечения воспалительных заболеваний не только кожи, но и внутренних органов [15].

Биологические эффекты комплекса GHK-Cu

Увеличение количества коллагена, гликозаминогликанов и декорина

Гликозаминогликаны, протеогликаны, коллаген и фибронектин служат основными компонентами экстрацеллюлярного матрикса соединительной ткани. Еще в 1988 г. F.X. Maquart et al. провели работу, в которой показали, что комплекс GHK-Cu усиливает синтез коллагена, причем этот эффект дозозависим, с максимальной стимуляцией при концентрации активного вещества 10-9 М [10].

Помимо структурной функции гликозаминогликаны и протеогликаны играют роль в заживлении ран, способствуя адгезии, миграции и пролиферации клеток. Кроме того, считается, что они могут регулировать активность факторов роста. В исследованиях Y. Wegrowski и F.X. Maquart (1992, 2004) показано, что комплекс GHK-Cu стимулирует синтез не только коллагена I и III типов, но и дерматан сульфата [12, 16]. Позже особое внимание стало уделяться протеогликанам, особенно декорину и биглюкану, поскольку они участвуют в организации фибрилл коллагена. A. Simeon et al. (2000) в своем исследовании показали, что добавление GHK-Cu in vitro значительно усиливает синтез коллагена, гликозаминогликанов и декорина, при этом не влияет на синтез биглюкана. Кроме того, под воздействием комплекса in vivo отмечено изменение соотношения гликозаминогликанов в сторону увеличения синтеза хондроитин сульфата [17].

T. Badenhorst et al. (2016) провели исследование на культуре дермальных фибробластов человека, в котором оценивали влияние препарата GHK-Cu на синтез коллагена, эластина и экспрессию мРНК MMP-1 и ММР-2, тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP)-1 и -2. На четвертые сутки после использования растворов GHK-Cu было зафиксировано значительное увеличение синтеза коллагена и эластина. Отмечался дозозависимый обратный эффект на синтез коллагена через 96 часов, синтез альфа-эластина увеличивался примерно на 30% независимо от концентрации GHK-Cu в препарате. С увеличением концентрации GHK-Cu в препарате уменьшались экспрессия MMP-1, TIMP-1 и количество коллагена [18].

Усиление ангиогенеза

Процесс неоангиогенеза в области раны регулируется сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF), основным фактором роста фибробластов (bFGF) и трансформирующим фактором роста бета (TGFβ) [2]. VEGF считается наиболее значимым сигналом стимуляции ангиогенеза в ране [19]. В исследовании Sen et al. (2002) оценивалось влияние препаратов меди на экспрессию VEGF на культуре кератиноцитов человека HaCaT и эпидермальных кератиноцитах взрослого человека. Установлено, что добавление препаратов меди значительно увеличивало экспрессию VEGF по сравнению с контрольной группой на обеих культурах клеток. Для дальнейшей оценки потенциала препаратов меди в заживлении ран использованы экспериментальные модели на животных (мыши BalbC). Результаты оценивались на 5-е сутки. Отмечено не только значительное уменьшение площади ран при обработке препаратами меди, но и усиление пролиферации эпителиальных тканей с увеличением плотности клеток в гранулярном слое при обработке препаратами меди. Авторы сделали заключение, согласно которому ангиогенный потенциал меди может быть использован в ускорении процессов заживления ран [20].

В работе T.F. Lane et al. (1994), посвященной изучению свойств белка SPARC, также оценивали влияние GHK на эндотелиальные клетки. Так, добавление GHK незначительно влияло на ангиогенез. В то же время, если GHK предварительно обрабатывали раствором сульфата меди, отмечалось усиление ангиогенеза по силе, сопоставимое с bFGF [21].

Усиление роста нервных волокон

Часто вследствие неадекватного процесса регенерации отмечается снижение чувствительности в поврежденной области. GHK повышает продукцию нейротропных факторов, способствуя восстановлению иннервации кожи после повреждения [22].

Противовоспалительный и антиоксидантный эффекты

S.O. Canapp et al. (2003) установили, что GHK-Cu улучшает заживление ишемических ран и подавляет воспаление за счет уменьшения количества цитокинов острой фазы воспаления, таких как TGF-β и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) [23].

A. Gruchlik et al. (2012) оценивали влияние двух пептидов (GGH и GHK), их медных комплексов и сахаромицетно-медного фермента на секрецию нормальными человеческими дермальными фибробластами эпидермального интерлейкина-6, играющего критическую роль в процессе нормального заживления ран. Обнаружено, что комплекс GHK-Cu уменьшает оксидативный стресс за счет регуляции уровней железа и нейтрализации токсичных продуктов перекисного окисления липидов. Также меднопептидные комплексы уменьшали TNF-α-зависимую секрецию интерлейкина-6 фибробластами. Авторы предполагают, что меднопептидные препараты в будущем могут быть использованы как альтернатива кортикостероидным и нестероидным противовоспалительным препаратам, имеющим гораздо более широкий спектр побочных эффектов [24]. Позже те же авторы (2014) более детально проанализировали влияние GHK-Cu на секрецию TGF-β фибробластами в исследовании на культуре фибробластов in vitro. Было выдвинуто предположение, что меднопептидный комплекс обладает способностью угнетать секрецию «фиброгенного» TGF-β фибробластами и как следствие – регулировать избыточное рубцеобразование [25].

Увеличение стволового потенциала клеток

В работе Y.A. Kang et al. (2009) изучено влияние GHK-Cu на базальные кератиноциты: выявлено значительное увеличение экспрессии интегринов, белка p63, а также ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA). Полученные результаты свидетельствуют о повышении пролиферативного потенциала базальных кератиноцитов после использования трипептида меди [26]. H.R. Choi et al. (2012) были получены аналогичные результаты. Кроме того, исследователи отмечали изменение морфологии базальных клеток: они приобретали более кубоидную форму, что также, по заключению авторов, свидетельствует об усилении стволового потенциала изучаемых клеток [27].

Бактерицидный эффект

Длительное пребывание нейтрофилов в активном состоянии на фоне инфицирования/обсеменения ран различными патогенами приводит к синтезу цитолитических ферментов и свободных радикалов кислорода, избыточной выработке провоспалительных цитокинов. Присутствующие метаболиты и токсины провоцируют развитие тканевой гипоксии, отмечается снижение количества фибробластов и синтеза коллагена, нарушается реэпителизация. Кроме того, микроорганизмы используют для своей жизнедеятельности питательные вещества и кислород, необходимые для правильного протекания процессов регенерации. Таким образом, сохранение асептических условий в ране служит важным условием для нормального заживления, особенно при хронических раневых процессах [2]. В работе И.В. Бабушкиной и соавт. (2010) показано, что препараты на основе наночастиц меди обладают выраженной антибактериальной активностью в отношении клинически значимых штаммов Staphylococcus aureus [28].

Нормализация процессов заживления ран и тканевой регенерации

В исследованиях, проведенных A. Simeon et al. (1999), показано, что комплекс GHK-Cu увеличивал количество молекул – предшественниц MMP-2 в раневом отделяемом за счет увеличения их синтеза фибробластами. При той же концентрации GHK-Cu стимулирует синтез коллагена и гликозаминогликанов культивированными человеческими фибробластами. Таким образом, можно говорить о том, что GHK-Cu одновременно усиливает процессы синтеза и ремоделирования экстрацеллюлярного матрикса. По результатам исследования был сделан вывод, согласно которому комплекс GHK-Cu служит ключевым компонентом, стимулирующим синтез предшественника MMP-2. Стоит отметить, что при регенерации кожи MMP-2 обнаруживается в соединительной ткани, а MMP-9 – в мигрирующих кератиноцитах и влияние этих двух металлопротеиназ считается критически важным для нормального заживления ран [29]. Несколько противоречивым может показаться тот факт, что при добавлении к культуре фибробластов GHK-Cu одновременно повышался синтез предшественников MMP-2 и ее ингибиторов – TIMP-1 и TIMP-2.

Однако, формируя ковалентные связи с молекулами металлопротеиназ, TIMP модулируют их протеолитическую активность, таким образом регулируя процесс ремоделирования тканей. Еще одним свойством TIMP-1 и TIMP-2 является их способность работать как фактор роста для некоторых клеток. В частности, TIMP-2 стимулирует пролиферацию фибробластов посредством повышения активности протеинкиназы А [30].

Влияние трипептида меди GHK-Cu на процессы кожной регенерации

За более чем сорокалетнюю историю изучения GHK-Cu было проведено множество исследований с использованием экспериментальных моделей, в которых изучалось влияние комплекса на процессы регенерации. Стоит отметить, что в подавляющем большинстве исследований GHK-Cu оказывал выраженный положительный эффект на процесс заживления различных раневых поверхностей. Так, в исследовании S.O. Canapp et al. (2003) показано, что топическое применение трипептида меди значительно ускоряло закрытие раневого дефекта у подопытных крыс при сравнении с группой плацебо и с группой, в которой использовалась гидроксипропил-метилцеллюлоза (лекарственная основа) [23].

I.T. Cangul et al. (2006) сравнивали влияние GHK-Cu и оксида цинка на заживление открытых ран у кроликов: было показано, что в группе GHK-Cu уже к 7-му дню формировалась полноценная грануляционная ткань, в то время как в группе оксида цинка и в контрольной группе она только начинала формироваться. Также к 7-му дню площадь ран в группе трипептида была значительно меньше, чем в группе оксида цинка и контрольной, однако к 21-му дню достоверной разницы между группами GHK-Cu и оксида цинка не отмечалось [31]. В работе А.А. Курцевой (2008) оценивалось влияние трипептида GHK и составляющих его аминокислот на репаративные процессы у крыс. Было установлено, что трипептид ускоряет заживление ран. Данные результаты подтверждались увеличением коэффициента относительного ранозаживления в 1,8 раза по сравнению с контрольной группой. Максимальный эффект развивался к 6–10-м суткам, что отражалось еще большим повышением коэффициента относительного ранозаживления – в 2,7 раза [32].

Использование трипептида меди GHK-Cu в клинической практике

Клинические исследования с использованием препаратов на основе GHK-Cu немногочисленны, а их результаты противоречивы. В проспективном рандомизированном слепом плацебо-контролируемом исследовании J.B. Bishop et al. (1992) сравнивали эффективность GHK-Cu (0,4%-ный крем) и сульфадиазина серебра (1%-ный крем) с плацебо у 86 пациентов с хроническими венозными язвами. К концу 4-й недели наблюдалось значительное уменьшение размеров язв у пациентов группы сульфадиазина серебра по сравнению с группами трипептида и плацебо, а между последними двумя группами статистически значимых различий не было [33]. Однако в 1994 г. G.D. Mulder et al. провели рандомизированное мультицентровое слепое плацебо-контролируемое исследование, в котором оценивали эффективность и безопасность 2%-ного геля с GHK-Cu при лечении нейропатических язв у больных сахарным диабетом после проведения хирургической обработки. Были получены следующие результаты: в группе пациентов, использовавших гель с GHK-Cu, закрытие язвенных дефектов происходило в 3 раза быстрее, чем в группе, получавшей стандартное лечение, и в группе плацебо. Кроме того, авторы отмечали, что частота инфекционных осложнений была заметно ниже в группе трипептида меди [34].

Заключение

Комплекс GHK-Cu обладает широким спектром биологических эффектов, благодаря которым он может применяться в различных областях медицины, где требуется улучшение/ускорение процессов регенерации, в т.ч. для заживления кожных ран. GHK-Cu показал высокий профиль безопасности и эффективности при проведении исследований in vitro и в экспериментальных моделях in vivo. В то же время на сегодняшний день отсутствует убедительная доказательная база по использованию данного вещества в клинической практике, а результаты имеющихся немногочисленных клинических исследований противоречивы, в связи с чем представляется целесообразным проведение новых исследований по оценке реальной эффективности GHK-Cu в практической медицине.