Введение

Одной из наиболее важных медико-социальных проблем здравоохранения являются сосудистые заболевания головного мозга, значимость которых определяется их высокой долей в структуре заболеваемости и смертности, а также значительными показателями трудовых потерь и инвалидизации населения [1]. Ежегодная смертность от инсультов в России превышает аналогичный показатель в мире и составляет 175 случаев на 100 тыс. населения в год. Перенесенный инсульт налагает особые обязательства на членов семьи больного, значительно снижая их трудовой потенциал, и ложатся тяжелым социально-экономическим бременем на общество в целом [2]. Важно и то обстоятельство, что в последние годы имеет место тенденция к «омоложению» инсульта. Наблюдается увеличение его распространенности среди лиц трудоспособного возраста, как у мужчин, так и у женщин [3]. Все это обусловливает повышенный научный интерес к проблеме инсульта, поиску путей его профилактики и эффективного лечения [4].

Хотя инсульт в 1,25 раза чаще развивается у мужчин, суммарное число женщин, умерших от этого заболевания, существенно выше, что, возможно, связано с большей продолжительностью жизни женщин [5]. В структуре церебрального инсульта преобладают ишемические поражения головного мозга, доля которых достигает 65–75% [6].

Выделены различные подтипы ишемического инсульта (ИИ), что определяется разницей в механизмах формирования ишемии. Так, в случае развития атеротромботического подтипа инсульта (АТИ) его причиной служит атеросклероз церебральных артерий крупного или среднего калибра. Этот тип ИИ формируется ступенеобразно и характеризуется нарастанием симптоматики на протяжении нескольких часов или суток. Кардиоэмболический подтип инсульта (КЭИ) развивается вследствие полной или частичной закупорки эмболом артерии мозга и характеризуется высокой смертностью. Для своевременной диагностики и прогнозирования исходов при разных подтипах ИИ важной задачей является выявление наиболее информативных биомаркеров, в т.ч. генетических.

Различия в патогенезе подтипов ИИ определяются особенностями молекулярно-генетических механизмов, вовлеченных в этот процесс.

G.C. Jickling et al. (2010, 2012) установили, что мРНК гена CD46 может использоваться в качестве потенциального маркера для дифференциальной диагностики разных подтипов ИИ, т.к. CD46 является частью каскада комплемента, который регулирует развитие воспаления, наиболее характерного для АТИ [7, 8].

Цель настоящего исследования состояла в поиске генетических биомаркеров для прогнозирования исходов различных подтипов ИИ на основе анализа уровня экспрессии CD46.

Дизайн исследования

Дизайн исследования заключался в сравнении уровня экспрессии CD46 в образцах периферической венозной крови в группах с разными подтипами ИИ и в зависимости от пола.

Методы

В работе были использованы образцы РНК 79 неродственных индивидов, проживавших на территории Республики Башкортостан.

В группу обследованных больных разными подтипами ИИ вошли 21 пациент с КЭИ и 20 – с АТИ. Кроме того, в качестве группы сравнения был обследован 21 пациент с диагнозом «транзиторная ишемическая атака» (ТИА).

Контрольную группу составили 17 практически здоровых индивидов, сопоставимых с больными по возрасту, полу и этнической принадлежности, без хронических заболеваний, в т.ч. без патологии сердечно-сосудистой системы в анамнезе.

С целью изучения роли гена CD46 в развитии ИИ нами проводился молекулярно-генетический анализ уровня его экспрессии. Образцы РНК выделяли из плазмы периферической венозной крови больных тризоловым методом. Целостность РНК оценивали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле по соотношению интенсивностей полос, соответствовавших 28S и 18S рРНК. Синтез первой цепи кДНК проведен с помощью реакции обратной транскрипции. Анализ осуществлен методом ПЦР на термоциклере «RotorGeneQ» фирмы «QIAGEN» в режиме реального времени с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров фирмы «Евроген».

Статистическую достоверность различий между группами оценивали с помощью Т-теста Стьюдента, критерий Краскела–Уоллиса (k) или Манна–Уитни для каждого гена в каждой группе по сравнению с контрольной группой [9].

Данное исследование одобрено Комитетом по медицинской этике ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России.

Результаты исследования

При исследовании уровня экспрессии гена CD46 у пациентов с ТИА и в зависимости от подтипов ИИ статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой не выявлено. Так, уровень экспрессии гена CD46 в контрольной группе составил -0,34, при ТИА -0,75, при АТИ 5,11, при КЭИ -1,67 (k=2,945; р=0,40) (рис. 1). Отсутствие различий между исследуемыми группами обусловлено большой дисперсией (разбросом) показателя экспрессии в группах больных АТИ и КЭИ между мужчинами и женщинами.

С учетом различных патогенетических механизмов развития ТИА и ИИ у мужчин и женщин нами проведен анализ зависимости экспрессия гена CD46 от половой принадлежности.

Оказалось, что у мужчин группы больных ТИА уровень экспрессии гена CD46 составил 0,19, тогда как в группе контроля его значение было ниже, а именно -1,23 (U=12; p=0,094; рис. 2). У женщин наблюдалась противоположная картина: при развитии ТИА уровень экспрессии изучаемого гена был ниже, чем в группе контроля (-0,75 и 1,16 соответственно; U=12; p=0,088; рис. 3). В обоих случаях различия не достигли уровня статистической значимости, что, возможно, связано с небольшим объемом выборки пациентов с ТИА.

Однако при исследовании уровня экспрессии гена CD46 у пациентов с АТИ выявлены статистически значимые различия между мужчинами и женщинами (рис. 2, 3).

Так, у мужчин с АТИ наблюдалось значительное повышение уровня экспрессии гена CD46 по сравнению с группой контроля (7,18 и -1,23 соответственно; t=-2,53; p=0,024). Напротив, у женщин имела место обратная динамика: уровень экспрессии гена CD46 у больных оказался существенно ниже по сравнению с группой контроля (-2,11 и 1,16 соответственно; t=4,54; p=0,002).

Мы предполагаем, что выявленные различия между мужчинами и женщинами могут быть связанными с особенностями молекулярно-генетических механизмов воспаления в эндотелии сосудов, вовлеченных в патогенез развития АТИ, в частности гена CD46.

При анализе уровня экспрессии гена CD46 у больных КЭИ статистически значимых различий между больными и контролем, а также в зависимости от половой принадлежности не наблюдалось. Так, уровень экспрессии у мужчин составил 0,09, в контрольной группе – 1,23 (t=-0,67; p=0,516). В группе женщин уровень экспрессии гена CD46 оказался ниже, чем в контрольной группе (-5,92 и 1,16 соответственно; t=2,17; p=0,092), но различие также не было статистически значимым.

Полученные результаты можно объяснить отсутствием выраженных атеросклеротических изменений сосудов и воспалительного процесса в эндотелии при КЭИ.

Интересно отметить, что у женщин с наличием когнитивных расстройств уровень экспрессии гена CD46 оказался существенно выше, чем в контрольной группе (1,85 и 1,16 соответственно; U=7; р=0,042). У мужчин с наличием когнитивных расстройств различий в экспрессии изучаемого гена с контрольной группой не выявлено (U=49; р=0,423).

Обсуждение

ИИ известен своей высокой смертностью и заболеваемостью. Следовательно, необходимо определить более точные маркеры для различных подтипов инсульта, поскольку это будет иметь значение для своевременного выбора соответствующей терапии. Было продемонстрировано, что мРНК CD46 была в списке 40 мРНК, которые могут быть использованы в качестве потенциальных маркеров для различения подтипов ИИ. Среди этих 40 мРНК – CD46, по- видимому, непосредственно вовлечен в патофизиологию различных подтипов ИИ. CD46 является частью каскада комплемента, который регулирует воспаление, важнейший патологический процесс в патофизиологии ИИ. В этом исследовании мы показали, что уровень мРНК CD46 значительно изменяется при различных подтипах инсульта. Это наблюдение согласуется с современной литературой, которая предполагает, что атеросклероз, лежащий в основе патологии инсульта, в значительной степени обусловлен процессом воспаления [10].

Следует отметить, что дисфункция эндотелиальных клеток является важным признаком атеросклероза, и ранее сообщалось, что уровень белка CD46,повышен в атеросклеротической бляшке [11]. Следовательно, изменение регуляции мРНК CD46, обнаруженное у пациентов, согласуется с современными данными.

Заключение

Различия в патогенезе подтипов ИИ определяются разными генетическими механизмами, вовлеченными в развитие данного заболевания. Ранее было показано, что при ИИ происходит нарушение регуляции гена CD46 [12, 13]. В связи с этим изучение роли CD46 при различных подтипах ИИ представляется актуальной научной задачей.

В результате проведенного исследования нами показана важная роль гена CD46 в развитии атеротромботического подтипа ИИ. Сравнительный анализ с контрольной группой показал, что у мужчин с АТИ наблюдалось значительное повышение уровня экспрессии гена CD46, тогда как у женщин, напротив, уровень экспрессии гена CD46 оказался существенно ниже. Однако у женщин с когнитивными расстройствами уровень экспрессии гена CD46 оказался достоверно выше.

Полученные результаты свидетельствуют о важной роли гена CD46 в развитии данной патологии и возможности его использования в качестве генетического биомаркера атеротромботического подтипа ИИ.