Маркеры токсинов патогенной кишечной флоры у больных рожей


Ю.В. Юдина 1, О.Ф. Белая 1, 2, О.А. Паевская 1, Н.Н. Каншина 2, доцент; Ю.А. Белая 3, С.Г. Пак 2

1 НИИ Молекулярной медицины Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, Москва; 2 Кафедра инфекционных болезней МПФ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, Москва; 3 НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва
Проведена оценка дисбиоза кишечника по выявлению О-антигенов возбудителей острых кишечных инфекций (ОКИ), маркеров токсинов А и В Clostridium difficile и Шига токсина у 78 больных рожей на фоне антибиотикотерапии основного заболевания. Использована коагглютинация на стекле и планшетах. При поступлении в стационар у 75 % больных выявлялись О-антигены, у 72,5 % – А и В токсины C. difficile, у 45 % – Шига токсин, при этом у 20 % – в высоких титрах. Отмечен рост титров антигенов токсинов А и В C. difficile в кале у половины из числа больных, получавших цефазолин или гентамицин, и у трети – бензилпенициллин. Результаты свидетельствуют о дисбиозе кишечника (субклиническом) у больных рожей, усугубляющемся при антибактериальном лечении, что необходимо учитывать как при лечении рожи, так и при последующем наблюдении.

За последние 20 лет в клинической практике отмечается увеличение частоты случаев инфекции Clostridium difficile в связи с активным применением антибиотиков широкого спектра действия.
Практически любой антибактериальный препарат может вызывать С. difficile-ассоциированную инфекцию. По всему миру регистрируется множество внутрибольничных инфекций, вызванных С. difficile. В США на их долю приходится до 90 % всех случаев заражений при пребывании в стационаре (примерно 1 больной гастроэнтеритом С. difficile на 1000 госпитализированных) От 3 до 6 % здоровых людей являются носителями токсигенных клостридий, однако количество С. difficile в составе нормальной микрофлоры кишечника здорового человека не превышает 0,01–0,001 %. При приеме антибиотиков может происходить угнетение нормальной флоры и рост колонизации кишечника клостридия-
ми до 15–40 % [1–6].

Клиника заболевания варьируется от легкой диареи до угрожающих жизни заболеваний – псевдомембранозного колита и токсического мегаколона, возможно развитие бактерионосительства. Иногда псевдомембранозный колит протекает без диареи, что приводит к запоздалой диагностике и развитию тяжелых осложнений. Вероятность летального исхода диареи, вызванной гипервирулентным штаммом С. difficile, колеблется от 6 до 12 %. В некоторых случаях в самом начале болезни при появлении диареи на фоне антибиотикотерапии ее отмена может быстро приводить к обратному развитию симптомов заболевания [5–7].

Патогенное действие С. difficile опосредованно энтеротоксином А (308 kDa) и цитотоксином В (270 kDa), которые являются главными факторами патогенности возбудителей. Токсин А – это летальный энтеротоксин, обусловливающий кровоизлияния и секрецию жидкости в кишечнике, а токсин В – это цитотоксин, обладающий цитопатическим эффектом в культуре ткани. Оба токсина модифицируют RAS-подобные протеины эукариотических клеток, разрушают клеточные мембраны, актиновый
аппарат клетки и синтез протеинов, стимулируют секрецию жидкости, увеличивают проницаемость кишечной стенки, нейтрофильную инфильтрацию и воспаление, активируют провоспалительные цитокины – лейкотриен В4, простагландин Е2, фактор некроза опухоли α, интерлейкин-8. Именно эти токсины рассматриваются в качестве ключевых компонентов для создания диагностических, лечебных и профилактических препаратов [8–12].

Тяжесть инфекции, вызванной С. difficile, во многом определяется активностью иммунного ответа человека на возбудитель и, в частности, на его токсины. Показано, что повышение титров антител к токсину А сопровождается снижением патогенности С. difficile и повышает вероятность бессимптомного носительства [13, 14].

Факторами риска антибиотико-ассоциированного колита (ААК) являются продолжительное пребывание в стационаре, особенно в одной палате с носителями С. difficile, возраст (менее 6 лет или более 65 лет), заболевания органов пищеварения, угнетение иммунной системы, предшествующий
дисбиоз кишечника. Даже однократный прием антибиотика широкого спектра действия может приводить к развитию ААК и псевдомембранозного колита вне зависимости от дозы и способа введения. В 80 % случаев симптоматика развивалась в течение трех дней с момента применения препарата [2–6].

Особенностью инфекции С. difficile являются ее частые рецидивы – в среднем в 20–25 % случаев, причиной которых являются сохранившиеся в кишечнике споры С. difficile или повторное заражение. Возникновение рецидива связано с уменьшением в плазме крови концентрации антител иммуноглобулина G к токсину А и уменьшением числа клеток слизистой оболочки толстого кишечника,
секретирующих иммуноглобулин A [14, 15].

В лечении рожи широко применяются антибактериальные препараты, часть из них может оказывать негативное влияние на кишечную флору. Кроме того, еще до поступления в стационар больные рожей могут иметь в составе кишечной флоры различные клостридии или возбудителей традиционных кишечных инфекций (шигелл, сальмонелл, иерсиний и др.), попавших в организм с пищевыми продуктами или водой, даже без явных клинических признаков кишечной инфекции (транзиторное носительство, субклинический вариант течения). В этих случаях на фоне антибиотикотерапии рожи возможно усиление дисбиоза и даже развитие антибиотико-ассоциированной диареи.

Выявление токсинов возбудителей в организме больных представляет значительные трудности, методики их определения (в частности, хроматографический метод) не входят в стандартный спектр таковых обследования пациентов и недостаточно чувствительны [16, 17].

Ввиду сложности бактериологической диагностики клостридиальных и других кишечных инфекций в обычной клинической практике исследование эндотоксинов возбудителей кишечных инфекций и их токсинов в качестве показателей дисбиоза кишечника у больных рожей на фоне антибактери-
ального лечения не проводилось.

Как мы показали в ранее проведенных исследованиях, присутствие токсинов клостридий у больных значительно усиливает проявления интоксикационного синдрома и утяжеляет течение острых кишечных инфекций (ОКИ). Кроме клостридиальных токсинов другим важным токсином, вырабатываемым кишечной флорой, является Шига токсин (ШТ), это наиболее широко распространенный токсин представителей семейства Enterobacteriaceae, а также некоторых других видов бактерий, он является важным фактором патогенности бактерий, обитающих в кишечнике.
Обнаружение его маркера (антигена) наряду с выявлением специфических О-антигенов шигелл, сальмонелл, йерсиний и кампилобактерий свидетельствует о присутствии в кишечнике патогенных бактерий и дисбиозе [17–19].

Целью работы стала оценка дисбиоза кишечника на основании выявления О-антигенов и маркеров токсинов А, В С. difficile и ШТ у больных рожей на фоне антибиотикотерапии основного заболевания.

Материал и методы

Обследованы 78 больных эритематозно-геморрагической и буллезно-геморрагической рожей конечностей и лица (45 – первичная рожа, 33 – рецидивирующая рожа). У 32 больных были выявлены сопутствующие заболевания, как правило, сопровождавшиеся иммунодефицитным состоянием (цирроз печени, язвенная болезнь, сахарный диабет, ожирение, хронический бронхит и др.). У 46 больных сопутствующих заболеваний не было.

Антибактериальное лечение больных осуществлялось с применением бензилпенициллина (6–12 млн ЕД/сут внутримышечно в течение 10 дней) или (по показаниям) цефалоспорина 1-го поколения цефазолина (3–6 г/сут внутримышечно в течение 10 дней), линкомицина (1,5–2,0 г/сут перорально в течение 10 дней) или гентамицина (240 мг/сут внутримышечно в течение 7 дней).

Антигены токсинов А и В С. difficile, а также ШТ определены в реакции коагглютинации на планшете в негре-тых, осветленных центрифугированием копрофильтратах с использованием соответствующих диагностикумов. Исследование копрофильтратов на присутствие О-антигенов возбудителей кишечных инфекций (шигелл Зонне, Флекснера, Ньюкастл, сальмонелл В-, С1-, С2-, Д-, Е-серогрупп, йерсиний псевдотуберкулеза 1 и 111 серотипов, йерсиний энтероколитика О3, О7, 8, О9, кампилобактерий – Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari) проведено в реакции коагглютинации на стекле в гретых, осветленных центрифугированием копрофильтратах со специфическими антительными диагностикумами (разработаны и изготовлены в НИИЭМ
им. Н.Ф. Гамалеи) [20–23].

Контрольную группу составили 60 практически здоровых лиц. Статистическая обработка проведена
с использованием параметрических (t-критерий Стьюдента) и непараметрических (χ2) критериев на IBM PC (Biostatistica).

Результаты и обсуждение

В контрольной группе здоровых лиц О-антигены различных возбудителей ОКИ и маркеры токсинов С. difficile в кале не выявлены, а маркер ШТ (антиген) найден в 11 % случаев в титрах не выше 1 : 4 (lg10 обратного титра антигена токсина ≤ 0,602).

В копрофильтратах больных рожей ШТ А и В С. difficile в условном титре более 1 : 8 выявлены среди 72,5 % больных, ШТ – среди 45 % (р ≤ 0,05). При этом у 20 % больных определены в высоких титрах (≥ 1 : 250) маркеры токсинов А и В С. difficile и маркер ШТ (≥ 1 : 64).

У повторно обследованных больных (50 человек) уровни маркеров токсинов А и В С. difficile, а также ШТ
оставались без изменений в динамике заболевания в 28 %, 30 и 18 % случаев соответственно; снижение титров отмечено в 30 %, 32 и 36 % соответственно, повышение – в 28 % 24 и 32 % соответственно; и лишь в 14 % случаев маркеры токсинов не были выявлены. В итоге к моменту выписки больных из стационара у 64 %, 66 и 28 % из них в кале присутствовали маркеры, вышеуказанных ток-

синов, причем у каждого третьего больного – в высоких титрах маркеры токсина А и В С. difficile, а в
18 % случаев – маркер ШТ в высоких титрах.

У больных первичной рожей в 1–3-й дни заболевания средние уровни маркеров токсинов А и В С. difficile (lg10 обратного титра антигена) составляли 1,404 ± 0,278 и 1,371 ± 0,269 нарастали до 1,648 ± 0,228 и 1,538 ± 0,221 к 4–6-му дням болезни и снова снижались до исходного уровня к 7–10-му дням болезни (1,433 ± 0,215 и 1,349 ± 0,219 соответственно). Динамика ШТ в целом повторяла тенденции изменения уровней маркеров токсинов С. difficile, несколько нарастая к 4–6-му дням с 1,0 ± 0,154 до 1,144 ± 0,174 и возвращаясь к уровню 1,0 ± 0,225 на 7–10-й дни болезни (рис. 1).

Рисунок 1. Динамика уровней маркеров токсинов кишечных бактерий в КФ у больных рожей (Lg10 обратного титра маркера токсина) (n=78).

У больных рецидивирующей рожей динамика уровней маркеров токсинов С. difficile была противоположна тенденциям, наблюдавшимся при первичной роже. У больных рецидивирующей рожей средние уровни токсинов А и В С. difficile в 1–3-й дни заболевания составляли 1,751 ± 0,297 и 1,505 ± 0,229 соответственно, затем снижались до 1,355 ± 0,279 и 1,08 ± 0,231 к 4–6-му дням болезни и снова нарастали к 10-му дню болезни до уровня 1,482 ± 1,336 и 1,091 ± 0,412 соответственно. Уровни ШТ в 1–3-й дни болезни составляли 0,301 ± 0,114 и были достоверно ниже, чем при первичной роже (р ≤ 0,004), затем они достоверно нарастали к 4–6-му дням до 1,455 ± 0,239 (р1-3 ≤ 0,05) и снижались к 10-му дню болезни до 0,151 ± 0,09 (р4-6 < 0,05).

О-антигены различных возбудителей кишечных инфекций были выявлены всего среди 75 % больных (при первичной роже – среди 70 %, при рецидивирующей роже – среди 76,7 %). При этом у 65 % больных одновременно с О-антигенами выявлены токсины А и В С. difficile и ШТ.

Больные, у которых рожа протекала на фоне сопутствующих заболеваний, имели в копрофильтратах больше О-антигенов и маркеров токсинов, чем больные без сопутствующей патологии. Так, у больных рожей с сопутствующими заболеваниями выявлено в среднем 2,06 О-антигена в пробе копрофильтрата, а в группе без сопутствующих заболеваний – 1,43. Нагрузка токсинами А и В С. difficile и ШТ в группе пациентов с сопутствующими заболеваниями составила 1,22, без сопутствующих заболеваний – 0,91 (рис. 2).

"Нагрузка" маркерами токсинов у больных рожей в зависимости от сопутствующих заболеваний

В динамике течения рожи у пациентов с сопутствующими заболеваниями уровни маркеров токсинов А и В С. difficile в кале в ходе заболевания нарастали в два раза чаще, чем у пациентов без сопутствующих заболеваний.

При исследовании влияния различных антибактериальных препаратов, применяемых в лечении рожи, был отмечен достоверный рост титров маркеров токсинов А и В С. difficile среди 27 % больных, леченных только с применением бензилпенициллина, среди 50 % больных, получавших цефазолин или гентамицин, и среди 11 % больных в случае лечения линкомицином.

При этом мы не отметили существенной разницы в частоте выявления роста титров клостридиальных
токсинов между больными первичной и рецидивирующей рожей. Как правило, направленность изменения титров токсина В С. difficile совпадала с таковой токсина А.

Маркер ШТ имел тенденцию к более частому достоверному росту его титров (≥ 1 : 4) при лечении бензилпенициллином (35,3 % больных), чем при лечении гентамицином или цефазолином (27,3 %, р ≥ 0,05).

В целом у 30 % больных рожей мы отметили рост титров маркеров ШТ и токсинов А и В С. difficile в динамике заболевания, что свидетельствовало о нарастании дисбиотических процессов в кишечнике.

Следует заметить, что в спектре биологической активности бензилпенициллина указываются спорообразующие анаэробные палочки, а линкомицина – клостридии. Полученные нами данные свидетельствуют, что назначение линкомицина при роже после проведенного курса лечения бензилпенициллином целесообразно не только с точки зрения элиминации L-форм стрептококка, но и для предупреждения возможных клостридиальных инфекций, развивающихся на фоне лечения в стационаре.

Таким образом, у значительного числа больных рожей при поступлении в стационар в копрофильтратах выявлены О-антигены различных возбудителей ОКИ и маркеры токсинов
клостридий и ШТ. Присутствие маркеров патогенной кишечной флоры – 0-антигенов возбудителей ОКИ, маркеров токсинов клостридий и ШТ свидетельствовало о дисбиозе кишечника у больных рожей, который был более выраженным у лиц с сопутствующими заболеваниями. Еще до применения антибактериального лечения среди значительного числа больных рожей выявлены маркеры токсинов А
и В С. difficile и ШТ в кале, в т. ч. в высоких титрах, однако их уровни не достигали таковых, характерных для больных ААК. В процессе проведения антибактериальной терапии отмечено достоверное нарастание уровня маркера токсина В С. difficile и некоторое нарастание продукции токсина А С. difficile. Однако это не сопровождалось клинически выраженными проявлениями колита, что может быть связано с относительно короткими курсами антибиотикотерапии и не столь высокими уровнями маркеров токсинов у больных рожей по сравнению теми, что наблюдаются у больных ААК и псевдомембранозным колитом. Как известно, возможность развития С. difficile-ассоциированных
заболеваний определяется взаимоотношениями самого возбудителя, уровня продуцируемого им токсина с факторами колонизационной резистентности индигенной микрофлоры [24].

Полученные данные позволяют отнести больных рожей, госпитализированных в стационар, к группе
риска возможного развития ААК, т. к. они, как мы установили, имеют лабораторные признаки субклинически протекающего дисбиоза кишечника. Представленные данные обусловливают необходимость своевременного выявления дисбиоза кишечника и проведения соответствующей корригирующей терапии пациентов данной группы, особенно с сопутствующими
заболеваниями, сопровождающимися иммунодефицитным состоянием (циррозом печени, язвенной болезнью, сахарным диабетом и др.), а также ставят вопрос о необходимости применения про- и пребиотиков в качестве поддерживающей терапии. Известно, что колит, диагностированный в ранней стадии, имеет благоприятный прогноз, симптомы быстро купируются, если антибиотикотерапия немедленно отменяется и проводится адекватная терапия. У пациентов с развившимися диареей и колитом после полного курса антибиотикотерапии, а также у тех, кому введение антибиотика продолжали, несмотря на диарею и колит, длительно сохранялась диарея с выраженным болевым синдромом и вероятностью летального исхода [6, 7, 10]. Полученные данные свидетельствуют о необходимости учитывать выявленные изменения микробиоценоза кишечника как при лечении рожи, так и при последующем наблюдении, и в случае проведения антибактериальной терапии (в т. ч. по поводу других заболеваний).

Примененная нами реакция коагглютинации с разработанными на основе натуральных и рекомбинантных антител диагностикумами в постановке на микропланшетах (учет результатов реакции через 12 часов) и предметных стеклах (учет через 0,5 часа) является быстрым и удобным методом выявления маркеров токсинов и О-антигенов возбудителей в копрофильтратах больных.

Выводы

1. Среди значительного числа больных рожей при поступлении в стационар в копрофильтратах выявлены О-антигены различных возбудителей ОКИ, маркеры токсинов А и В C. difficile, а также ШТ.
2. Отмечен достоверный рост титров антигенов токсинов А и В C. difficile в кале у половины из числа больных, получавших цефазолин или гентамицин, и у трети – бензилпенициллин.
3. Среди больных с сопутствующими заболеваниями при антибактериальной терапии отмечено достоверное нарастание продукции токсинов А и В C. difficile.


Литература


1. Бельмер С.В. Антибиотик-ассоциированный дисбактериоз кишечника // РМЖ 2004. Т. 12.
№ 3. С. 148–51.
2. Bartlett JG. Antibiotic-associated diarrhea. N Engl J Med 2002;346(5):334–39.
3. Kyne L, Warny M, Qamar A, Kelly CP. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum level of IgG antibody against toxin A. N Engl J Med 2000;342:390–97.
4. Лобзин Ю.В., Захаренко С.М., Иванов Г.А. Современные представления об инфекции Clostridium difficile // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2002. Т. 4. № 3. С. 200–32.
5. Малов В.А., Бондаренко В.М., Пак С.Г. Роль Clostridium difficile в патологии человека //Журн. микробиол. 1996. № 1. С. 91–6.
6. Miller MA, Hyland M, Ofner-Agostini M, et al. Morbidity, mortality, and healthcare burden of nosocomial Clostridium difficile-associated diarrhea in Canadian hospitals. Infect Control Hosp Epidemiol 2002;23:137–140.
7. Wistrom J, Norrby SR, Myhre EB, et al. Frequency of antibiotic-associated diarrhea in 2462 antibiotic-treated hospitalized patients: a prospective study. J Antimicrob Chemother 2001;47:43–50.
8. Branka JE, Vallettee G, Jarry A, et al. Early functional effects of Clostridium difficile toxin A on human colonocytes. Gastroenterology 1997;112:1887–94.
9. Hatheway CL. Toxigenic clostridia. Clin Microbiol Rev 1990;3(1):66–98.
10. Hogenauer C, Hammer HF, Krejs GJ, Reisinger EC. Mechanisms and management of antibioticassociated
diarrhea. Clinical Infectious Diseases 1998;27(4):702–10.
11. Belyi IF, Varfolomeeva NA. Construction of fusion protein cаrrying antigenic determinants of enteric clostridial toxins. FEMS Microbiol Lett 2003;225:325–29.
12. Varfolomeeva NA, Shmarova LA, Belyi IF. Geneengineering apporoach for the production of A
and B toxin fragments for diagnostic and immunotherapeutic use in Clostridium difficile infection. Mol Gen Microbiol Virusol 2003;2:13–6.
13. Kyne L, Warny M, Qamar A, Kelly CP. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet 2001;357: 189–93.
14. Kelly CP, Pothoulakis C, Orellana J, Lamont JT. Human colonic aspirates containing immunoglobulin
A antibody to Clostridium difficile toxin A inhibit toxin A-receptor binding. Gastroenterology 1992;102:35–40.
15. Katchar K, Taylor CP, Tummala S, et al. Association between IgG2 and IgG3 subclass responses to toxin A and recurrent Clostridium difficile-associated disease. Clin Gastroenterol Hepatol 2007;5:707–13.
16. Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Белый Ю.Ф. Пак С.Г. Выявление маркеров токсинов клостридий при различных вариантах течения острых кишечных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни 2008. № 3. С. 46–9.
17. Белая О.Ф., Гюлазян Н.М., Мартынова Н.Н. и др. Клиническое, диагностическое и прогностическое значение выявления маркера Шига токсина у больных острыми кишечными инфекционными заболеваниями // Сб. науч. трудов Инфекционная клиническая больница 2007. № 2. С. 11–5.
18. Белая О.Ф., Герасимова И.Е., Малов В.А. и др. Клиническое значение выявления маркера Шига токсина у больных острыми кишечными инфекционными заболеваниями // Кремлевская медицина. Клинический вестник 2004. № 2. С. 67–71.
19. Белая Ю.А., Белая О.Ф., Кудрявцева Л.Ю., Петрухин В.Г. Выявление антигена Шига-токсина в связи с другими факторами вирулентности 0- и К-антигенами энтеробактерий // Журнал микробиологии,
эпидемиологии и иммунобиологии 1993.№ 4. С. 13–20.
20. Реакция коагглютинации при кишечных инфекционных заболеваниях. Методические рекомендации. М., 1990. 12 с.
21. Белая Ю.А., Ценева Г.Я., Быстрова С.М. и др. Способ получения псевдотуберкулезных диагностикумов для реакции коагглютинации. Авт. свидетельство на изобретение
№ 1540491, зарег. в Госреестре изобретений РФ 1 октября 1989 г.
22. Белая Ю.А., Белая О.Ф., Быстрова С.М. и др. Способ получения диагностикума для выявления термостабильных антигенов кампилобактеров. Патент № 2086984, зарег.в Госреестре изобретений РФ 10 августа 1997 г.
23. Белая Ю.А., Прозоровский С.В., Быстрова С.М. и др. Способ постановки реакции коагглютинации. Авторское свидетельство наизобретение № 1182400, зарег. в Госреестре изобретений РФ 1 июня 1985 г.
24. Reeves A.E, Theriot CM, Bergin IL, et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile infection. Gut Microbes 2011;2(3):145–58.


Об авторах / Для корреспонденции


Юдина Юлия Владимировна – ГБОУ ВПО 1МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития РФ, старший научный сотрудник лаборатории по изучению токсических и септических состояний НИИ молекулярной медицины, E-mail jul175@mail.ru/
Белая Ольга Федоровна – ГБОУ ВПО 1МГМУ им. И.М.Сеченова, зав. лабораторией по изучению токсических и септических состояний НИИ молекулярной медицины, профессор кафедры инфекционных болезней МПФ, E-mail ofbelaya@mail.ru
Паевская Ольга Александровна, ГБОУ ВПО 1МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития РФ, старший научный сотрудник лаборатории по изучению токсических и септических состояний НИИ молекулярной медицины, E-mail paevskajao@rambler.ru.
Каншина Нина Николаевна, ГБОУ ВПО 1МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразви-тия РФ, доцент кафедры инфекционных болезней МПФ
Белая Юлия Александровна, НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития РФ, руков. группы иммунологии энтеральных инфекций
Пак Сергей Григорьевич, ГБОУ ВПО 1МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития РФ, Почетный профессор кафедры инфекционных болезней МПФ


Похожие статьи


Бионика Медиа